微陣列芯片 SELEX 技術(shù)篩選適配體

微陣列芯片及其分類

微陣列芯片是通過微點(diǎn)陣技術(shù)或微顆粒填充技術(shù)將數(shù)以萬計(jì)的生物探針固定在基板上,通過生物探針與溶液中的待測(cè)分子特異性結(jié)合完成分析和檢測(cè)過程。 微陣列芯片表面不存在微通道、微腔室等微結(jié)構(gòu),無需考慮流體在芯片內(nèi)部流動(dòng)造成的堵塞和氣泡等問題,降低了芯片加工和使用的難度。 另外,微陣列芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可通過計(jì)算機(jī)陣列分析技術(shù)獲得。

核酸微陣列芯片與蛋白質(zhì)微陣列芯片

核酸微陣列芯片常以玻璃、硅和塑料作為基板材料,通過光引導(dǎo)原位合成技術(shù)或物理遞送技術(shù)制造高密度核酸陣列,其中,物理遞送技術(shù),如噴墨或微噴射沉積,可將納升甚至皮升的溶液體積分配和點(diǎn)樣到微陣列芯片的特定部位。 微陣列芯片上檢測(cè)探針與帶有修飾的報(bào)告探針(如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性同位素等) 結(jié)合,通過檢測(cè)報(bào)告探針完成信號(hào)檢測(cè)。

與核酸微陣列芯片相同,蛋白質(zhì)微陣列芯片的構(gòu)建最初是直接將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣在相關(guān)載體上。 常用于制作蛋白質(zhì)微陣列芯片的載體有硝酸纖維素膜、硅樹脂、玻璃和塑料等。 載體的固定對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性和空間結(jié)構(gòu)的維持有一定的影響。 另外,常見的蛋白質(zhì)微陣列芯片的制備工藝中通常只點(diǎn)樣一種蛋白質(zhì),將多種蛋白質(zhì)點(diǎn)樣在一塊微陣列芯片上的報(bào)道較少。

微顆粒陣列芯片

微顆粒因其具有比表面積大、結(jié)合動(dòng)力學(xué)快的特點(diǎn)而在生化分析中得到廣泛應(yīng)用。 與傳統(tǒng)的平面微陣列芯片相比,微顆粒微陣列芯片利用其上的微顆?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的更快、更靈敏的檢測(cè)。 同時(shí),微顆粒微陣列芯片易實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的固定。

摻雜 DMAP 和丙烯酰胺/ 雙丙烯酰胺的溶液按照掩膜圖案進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng),形成微陣列芯片的微結(jié)構(gòu),并采用物理俘獲法實(shí)現(xiàn)微顆粒在微陣列芯片上的填充,有效克服了靜電自組裝和電場(chǎng)輔助組裝中微顆粒必須帶電的問題。 每塊芯片上有 40 個(gè)凝膠墊陣列單元,每個(gè)單元外周均以聚乙二醇微柱作為親水屏障,將試劑和樣品限制在微陣列芯片上。他們利用該芯片初步實(shí)現(xiàn)了前列腺特異性抗原和人絨毛膜促性腺激素的免疫測(cè)定。 Kim 等報(bào)道了一種微顆粒陣列芯片的加工工藝,即用停流光刻法進(jìn)行微顆粒的加工,通過負(fù)壓法實(shí)現(xiàn)微顆粒在陣列芯片上的填充。 另外,他們還通過改變掩膜圖案,制作出形狀各異的微顆粒,并成功生成了防偽應(yīng)用程序的二維粒子陣列代碼。

微陣列芯片不存在氣泡等問題帶來的干擾,而且微陣列芯片上固定的靶標(biāo)數(shù)量大、種類多。 特別是微顆粒陣列芯片的出現(xiàn),可使不同靶標(biāo)分子固定于不同微顆粒上,再將這些微顆粒填充于相應(yīng)區(qū)域,便于檢測(cè)且不會(huì)產(chǎn)生干擾。 微陣列芯片與 SELEX 技術(shù)的結(jié)合為發(fā)展新型適配體篩選技術(shù)提供了思路。

微陣列芯片 SELEX 在適配體篩選中的應(yīng)用

基于溶膠-凝膠的微陣列 SELEX 技術(shù)篩選適配體

基于微陣列 SELEX 技術(shù)篩選適配體時(shí),研究者將蛋白質(zhì)靶標(biāo)包裹于凝膠顆粒內(nèi),再點(diǎn)樣于微陣列芯片上,可有效維持蛋白質(zhì)的生物活性和空間結(jié)構(gòu)。 例如,Park 等將包裹有蛋白質(zhì)的凝膠顆粒點(diǎn)樣在微加熱器上,在微混合器的作用下,先后在微陣列芯片上完成寡核苷酸文庫(kù)與靶標(biāo)分子的結(jié)合、洗滌和洗脫等過程。 目前,利用該芯片可同時(shí)實(shí)現(xiàn) 5 種靶標(biāo)分子適配體的篩選。

溶膠-凝膠顆粒已廣泛用于大分子的捕獲,但將其應(yīng)用于小分子的捕獲時(shí)仍存在一定挑戰(zhàn),原因在于,若將溶膠-凝膠設(shè)計(jì)為截留小分子,通常會(huì)損害溶膠-凝膠顆粒與常規(guī)基質(zhì)(如微量滴定孔板聚合物)的粘附性。Ahn 等基于陽(yáng)極刻蝕技術(shù)和電化學(xué)工藝開發(fā)了一種多孔聚苯乙烯(PS)基質(zhì),該材料可有效錨定多種不同孔徑的溶膠-凝膠顆粒(圖 4)。 研究者將包裹雙酚 A 的溶膠-凝膠顆粒固定在 PS基質(zhì)上,考察了基于溶膠-凝膠顆粒的微陣列芯片 SELEX 技術(shù)篩選雙酚 A 適配體的可行性,為小分子適配體的篩選開辟了一條通用途徑。

圖 4 基于聚苯乙烯-溶膠凝膠芯片的適配體篩選技術(shù)示意圖

微陣列耦合微流控的 SELEX 技術(shù)篩選適配體

微流控芯片技術(shù)能較好地集成靶標(biāo)分子與寡核苷酸文庫(kù)的結(jié)合、洗滌和洗脫等篩選步驟,而微陣列芯片的超高通量的特點(diǎn)也有助于實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)分子適配體的同時(shí)篩選。 因此,微陣列耦合微流控的 SELEX 技術(shù)在適配體篩選中具有更大的優(yōu)勢(shì),可發(fā)揮更大的作用。

Liu 等發(fā)展了一種微陣列耦合微流控芯片的 SELEX 技術(shù)( Protein microarray integrated with amicrofluidic chip, PMM-SELEX),用于篩選蛋白質(zhì)的適配體(圖 5)。 利用物理俘獲法將靶標(biāo)分子吸附在微陣列芯片的蛇形微通道上,在靶標(biāo)分子與寡核苷酸文庫(kù)結(jié)合后,通過微陣列芯片掃描技術(shù)檢測(cè)靶標(biāo)分子與寡核苷酸文庫(kù)的結(jié)合情況。 研究結(jié)果表明,PMM-SELEX 技術(shù)省時(shí)、高效,僅需 5 輪篩選即可得到對(duì)乳鐵蛋白具有較高親和力(Kd = 0. 63 nmol / L)的適配體。

Gortrik 等通過將寡核苷酸文庫(kù)固定在微陣列芯片上,篩選出多條適配體候選物,并通過微流控技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)分別實(shí)現(xiàn)了適配體的分離與測(cè)序,克服了篩選過程輪次多、鑒定耗時(shí)等缺點(diǎn)。

圖 5 蛋白質(zhì)微陣列耦合微流控芯片的適配體篩選原理示意圖

適配體對(duì)(Aptamer pairs)可同時(shí)識(shí)別靶標(biāo)分子不同表位,有助于增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度和特異性。然而,適配體對(duì)很難通過篩選得到,因?yàn)樵诔Ｒ?guī)篩選過程中會(huì)優(yōu)先產(chǎn)生可識(shí)別顯性“熱點(diǎn)冶表位的適配體,而熱點(diǎn)表位適配體的確定,對(duì)另一表位的結(jié)合存在一定的阻礙作用。Cho 等建立的基于微陣列芯 片 的 適 配 體 對(duì) 篩 選 平 臺(tái)有效克服了這一問題,實(shí)現(xiàn)了適配體對(duì)的篩選(圖 6)。

圖 6 基于陣列的多價(jià)適配體篩選平臺(tái)示意圖

基于微流控及微陣列芯片 SELEX 技術(shù)的適配體篩選進(jìn)程監(jiān)測(cè)技術(shù)

適配體的篩選過程必須配合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù),從而有效地獲得具有更高親和力、更強(qiáng)穩(wěn)定性的適配體。

表面等離子體共振(Surface plasmon resonance, SPR)通過適配體候選物與靶標(biāo)分子結(jié)合引起的金屬膜表面共振角的改變對(duì) SELEX 篩選進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 雖然,利用 SPR 容易對(duì)適配體候選物與靶標(biāo)分子的結(jié)合情況進(jìn)行評(píng)估,但早期研究發(fā)現(xiàn),大多情況下,第 1 輪篩選并未檢測(cè)到 SPR 信號(hào)的變化,顯然傳統(tǒng)的 SPR 并不適于高通量檢測(cè)。 將金納米顆粒引入 SPR 的局域表面等離子體共振可有效增強(qiáng) SPR 信號(hào)的輸出。

Gifford 等使用金納米顆粒增強(qiáng)的 SPR 成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR 產(chǎn)物的高靈敏檢測(cè)。 與金納米顆粒相比,銀納米顆?？僧a(chǎn)生更強(qiáng)的共振信號(hào),據(jù)此構(gòu)建的“金核銀殼冶結(jié)構(gòu)可更好地監(jiān)測(cè)篩選過程。 Jia 等將微流控芯片和 SPRI 技術(shù)整合至 SELEX 過程中,利用十面體銀納米顆粒(Ag10 )增強(qiáng)表面等離子體共振信號(hào)強(qiáng)度,完成了對(duì)乳鐵蛋白的適配體的篩選,將檢測(cè)信號(hào)提高了 128 倍。 在后續(xù)的研究中,Jia 等利用十面體銀納米顆粒探針(Ag10-NPs-RP15 )在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) SELEX 過程的同時(shí),消除了因靶標(biāo)分子末端固定導(dǎo)致的其與適配體候選物親和力降低的影響,篩選得到了脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-1(Lipocalin-1)的適配體。

表 1 傳統(tǒng) SELEX 技術(shù)與基于微流控芯片和微陣列芯片 SELEX 技術(shù)的對(duì)比

小分子與適配體分子量差異較大,兩者親和力的表征也是難點(diǎn)之一,目前尚無通用的表征方法。Ahn 等將包埋有 BPA 的溶膠-凝膠顆粒固定在微陣列芯片上,利用熒光素標(biāo)記 BPA 適配體候選物,與小分子結(jié)合的適配體候選物無法從溶膠-凝膠顆粒中逃逸,從而可觀察到顆粒的熒光。 但是,這種熒光標(biāo)記探針的方式對(duì)適配體的折疊有潛在影響,可能會(huì)進(jìn)一步影響適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合。 表征小分子與適配體親和力的另一種方法是反向散射干涉術(shù)(Back scattering interferometry, BSI),即利用激光照射樣品,光束在通道內(nèi)被反射和折射,形成特定的條紋圖案,并由電耦合器件( Charge coupled device, CCD)實(shí)現(xiàn)陣列檢測(cè)。 監(jiān)測(cè)過程中,適配體和靶標(biāo)分子均游離在溶液中,無需固定和標(biāo)記。Kammer 等成功地將該技術(shù)用于抗生素(如替諾福韋、表阿霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素)以及激素、神經(jīng)遞質(zhì)等小分子與適配體的親和力表征研究中。

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