1、什么是海藻酸鈉微球

海藻酸鹽(海藻酸鈉)又稱褐藻酸鈉，是一類從褐藻、海帶、馬尾藻、巨藻等可食用的海洋藻類植物的細胞壁中提取出的天然線性多糖，由1-4糖苷鍵鍵合的β-D-甘露糖醛酸(M單元)和α-L-古洛糖醛酸(G單元)殘基組成。海藻酸鈉作為微球載體材料已經多有報道，如劉善奎等利用乳化-交聯法制備的DNA疫苗海藻酸鈉微球，其粒徑在12.03±6.9μm，載藥量為5%，包封率為56%，藥物釋放維持10天。以下圖1是海藻酸鈉結構式。

圖1 海藻酸鈉的結構式

海藻酸鈉微球的研究意義：在藥劑學中，微球(microspheres)是指藥物被溶解、分散或被吸附在藥物載體材料如高分子聚合物中而形成的骨架型(matrixtype)球形微粒。微球的主要作用包括：靶向性作用、緩釋與控釋作用、栓塞作用、降低藥物刺激性和提高藥物穩定性作用。微球栓塞劑的性能也隨著介入治療在臨床治療中地位的提升而逐漸引起科研人員的重視。介入栓塞術是借助于導管將栓塞劑選擇性地導入到癌癥組織動脈血管和微血管，以達到阻斷腫瘤組織營養供給，抑制其生長的目的。另外，對于無法手術治療的肝癌患者，介入栓塞術可控制病變部位惡化，減少患者疼痛，起到提高生存質量的作用。栓塞劑對栓塞術的成功起著至關重要的作用。綜合來說，一種理想的栓塞材料應該具備無毒、無抗原性、生物組織相容性好、可根據病灶要求控制栓塞時間等特點，而且制劑易制備，易導入，易滅菌，粒徑的均一性可控性，成本低廉也是選擇栓塞材料必需考慮的重要因素。天然多糖高分子微球由于具有良好的生物相容性和生物可降解性而備受介入治療領域的關注，在臨床應用方面具有良好的前景。海藻酸鈉是一種常用的天然多糖高分子材料，由L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸兩種糖單元構成。海藻酸鈉主要由海藻類植物提取而來，具有易得、易改性、生物相容性良好等優點。海藻酸鈉可與Ca2+，Zn2+等離子交聯反應形成“蛋盒”結構，產生大分子鏈間交聯固化，可根據臨床需要加工制備成各種粒徑大小的固態微球。海藻酸鹽微球具有良好的力學穩定性和生物相容性，栓塞血管后無免疫反應，且其可降解性使得一段時間后以分子鏈脫解的形式降解，終產物為能為人體代謝的多糖。目前國內已有海藻酸鈉微球血管栓塞劑上市，但產品存在粒徑分布范圍廣、尺寸不可控、只能通過粒徑控制降解周期等問題，粒徑不均一、不可控的微球在臨床使用過程中容易造成除靶血管外的其他組織或器官栓塞，尤其是粒徑微小(20μm以下)的微球容易通過血液流向肺部，造成危及生命的肺部栓塞;只通過粒徑控制降解周期的微球，不能很好地滿足病灶點的栓塞要求，容易出現粒徑合適但是栓塞時間不充分的情況，不僅影響治療效果，而且需多次栓塞給病患增加麻煩。目前研究中制備載藥海藻酸鈉微球的方法，大多采用靜電生成法、相分離法、復相乳液法或攪拌乳化法形成液滴，然后與鈣離子交聯形成微球。以上方法制備的微球粒徑分布較廣，不易控制，且不易實現規模化生產。目前有望解決上述問題的是利用微流控芯片技術制備海藻酸鈉微球，該方法制備的海藻酸鈉微球粒徑均一、尺寸可控，在同一粒徑范圍內可控制其降解速度。

2、利用微流控芯片技術制備海藻酸鈉微球的原理及方法

使用微流控芯片技術制備海藻酸鈉微球，常采用流道聚焦法來生成油包水的微液滴。如下圖所示，在流動聚焦法中，三條流路聚焦一個管道中，分散相和流動相匯合于十字交叉管處，上下對稱的流動相同時擠壓分散相使其斷裂，從而形成液滴。通常分散相為海藻酸鈉水溶液，流動相為油相，兩相流經聚焦型結構的十字處，擠壓形成海藻酸鈉液滴。

圖2 流道聚焦法制備海藻酸鈉微球

3、制備海藻酸鈉微球所需的試劑

(1) 微滴生成油 (含2% 表面活性劑的HFE-7500 (wt%))

(2) EDTA (0.5 M, pH 7.4 Macklin, E885215-1L)

(3) NaOH (Macklin, S817971-500 G)

(4) CaCl2 (無水, 99.99%, Macklin, C805228-100 G)

(5) 海藻酸鈉 (黏度 200 mpa.s)

(6) 乙酸 (99.8%, Macklin, A801296-500 ML)

(7) 1H,1H,2H,2H-全氟己-1-醇 (PFO, 98%, Macklin, H817022-25 G)

(8) HFE-7500 (3M NovecTM)

(9) n-Hexane (正己烷, HPLC, H810749-1L)

(10) SpanTM 80 (Aladdin, S110839-250 ML)

(11) 去離子水

4、制備海藻酸鈉微球所需的實驗儀器

(1) 兩通道微流控芯片進樣用恒壓泵也稱壓力控制器

(2) 100 μm剪切口疏水的微流控玻璃芯片(液滴)

(3) 配套微流控玻璃芯片夾具

(4) PTFE 管(0.6/1.6 mm)若干

(5) 配有高速相機的普通光學顯微鏡及配套軟件

(6) 兩個流量傳感器 (規格: 80 μL/min)

(7) 兩個儲液池 (規格: 15 mL和50 mL)

(8) 水平旋轉儀

(9) 萬分位電子分析天平

(10) 梅特勒pH計

(11) 高速離心機

(12) 100 μm細胞濾網

(13) 20 mL透明玻璃瓶

(14) 玻璃培養皿 (直徑100 mm)

圖3 采用微流控液滴芯片制備的海藻酸鈉微球粒徑分布

5、制備海藻酸鈉微球的溶液配制方法

（1）4 M NaOH

取8.0 g NaOH置于50 mL Falcon離心管中，用去離子水溶解并定容至50 mL。

（2）5 M CaCl2

取11.1 g CaCl2置于50 mL Falcon離心管中，用去離子水溶解并定容至20 mL。

（3）2 %海藻酸鈉水溶液 (wt%)

取0.2 g 海藻酸鈉置于15 mL Falcon離心管中，加入去離子水至10 g。

注意：溶解海藻酸鈉時用時較久，要不斷的超聲并渦旋振蕩，最后靜置將個別碎沫慢慢溶解 (以上僅為個人建議，不同廠家溶解效果也不一樣，能否做出也未可知)。

（4）400 mM Ca-EDTA

取400 μL 的5 M CaCl2 ，4 mL EDTA (0.5M, pH7.4)加入20 mL 透明玻璃瓶中并振蕩均勻，然后用 4 M NaOH調整pH至7.2，最后加入去離子純凈水定容至5 mL。

注意: 調pH加NaOH溶液時，需少量多次。初始pH為3.65左右，待加至pH為5.6以上時需盡可能減少NaOH溶液加入的量，適當可用移液槍取1 μL 或更少的量加入。

（5）1% 海藻酸鈉 (wt%)- 200 mM Ca-EDTA

將2 % 海藻酸鈉水溶液和400 mM Ca-EDTA等體積混合，使用0.22 μm PTFE微孔膜過濾。

（6）20% PFO/HFE-7500 (v/v)

取5 mL PFO 置于50 mL Falcon離心管中，用HFE-7500定容至25 mL，振蕩均勻。

（7）1% Span 80 in Hexane (v/v)

取0.3 mL Span 80加入Hexane定容至30 mL，振蕩均勻.

（8）2 % 乙酸/微滴生成油 (v/v)

取200 μL 的乙酸加入 15 mL Falcon離心管中，用微滴生成油定容至10 mL，振蕩均勻。

6、利用微流控芯片技術制備海藻酸鈉微球的實驗操作

(1) 連接設備、儲液池和兩路流量傳感器；

(2) 將微滴生成油和1% 海藻酸鈉-200 mM Ca-EDTA水相分別加入至50和15 mL的儲液池中;

(3) 用軟件控制分別給兩個通道一定的壓力以排出管路中的空氣，待有液體流出時再分別關掉壓力;

(4) 分別將油相和水相管插入經疏水處理的玻璃芯片對應的油相和水相入口（玻璃芯片安裝在夾具上，直接將導管插入夾具即可），然后取一段30 cm PTFE管插入玻璃芯片出口；

(5) 用軟件控制并設置流速，比如油相流速為70 μL /min，水相流速為7 μL /min;

(6) 待微球穩定生成后，將裝有10 mL 2%乙酸微的滴生成油的玻璃培養皿放置于管路出口開始收集，且收集過程中需要用水平旋轉儀振蕩;

(7) 注意：水平旋轉儀振蕩速度50 rpm/min以下，且保證收集的微球一直能滴入培養皿中；收集時可以用保鮮膜蓋在收集管上盡量減少乙酸的揮發

(8) 收集完畢后可以適當補充乙酸以保證其濃度基本維持不變，然后振蕩固化12 h；

(9) 待固化完全后，5000 rpm, 3min離心處理；

(10) 用移液槍取出底部油相，然后按2:1 (vPFO:v微球)加入20% PFO的HFE-7500，5000 rpm, 3min離心處理至少兩次;

(11) 用移液槍取出底部溶液，然后按2:1 (vn-Hexane:v微球)加入1% Span 80的n-Hexane，5000 rpm, 3min離心處理至少兩次；

(12) 用移液槍取出上部溶液，加入一定體積PBS 5000 rpm, 5min離心處理，最終分散于PBS中;

(13) 固化后的微球可以用100 μm細胞過濾器過濾。

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