在工農醫等行業，如水質、土壤、食品和藥品中，檢測尿素的含量有著重要的意義。實驗室常規尿素檢測方法如凱氏定氮儀法和市售的尿素測定儀均有著耗時長、儀器昂貴和化學試劑用量大等缺點，還伴隨著不可避免的環境污染。另一類常見的檢測方法如拉曼光譜和電化學法，操作復雜且成本較高。還有一些科研工作者提出用顯色法或顯色試紙的方法來檢測尿素含量。1986年，高世忠等[7]提出了二乙酰一肟與尿素反應生成有色復合物的方法，通過是否顯色來判斷有無尿素，但二乙酰一肟并非只與尿素反應顯色，與其代謝產物瓜氨酸反應也有顯色，此種測量方法并不能排除瓜氨酸對尿素濃度的影響。2009年，楊水云等發明了一種檢測尿素含量的試紙，制備試紙的過程較為復雜且不易保存，保存和現場測試過程中較易受環境因素如pH值、濕度等的影響。2012年，喻東威等提出了一種定性檢測尿素的方法，用溴百里香酚藍乙醇溶液對尿素的酶溶液進行顯色反應。該方法只能通過陽性對照組來比較，且操作過程復雜，試劑用量大，易對環境造成污染。

微流控技術由于消耗樣品和試劑量少、分析速度快、便攜以及高自動化水平等優點引起了生物化學分析領域的諸多關注。由于酶的高選擇性、靈敏度和快速性，通過微流控酶促反應進行分析檢測已有諸多報道。Schekman等通過微流控油水液滴可實現超高通量定向進化分選，但需要復雜昂貴的設備如電場、激發光源等。并且，引入環境不友好的油相可能會影響酶的3D結構。因此，實現一種簡單、快速、可視化、生物相容的分析檢測方法仍是一個持續的挑戰。雙水相生物相容性好，具有選擇分配性。通過雙水相產生穩定均一的液滴流的方法已日趨成熟，在功能材料的制備、生物活性物質的包封和培養等領域均有報道。雙水相的上述特點對于有生物活性物質參與的分析檢測有巨大的潛力。基于此，我們構建了一個基于酶促反應的微流控雙水相液滴流平臺用于尿素檢測。如圖 1所示，在同軸環管型毛細管微裝置中，利用兩相流體的剪切作用在錐口處產生聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)液滴(圖 1A)，液滴內含有尿素和中性紅指示劑，外相含有脲酶；尿素與脲酶在雙水相液滴界面發生酶促反應(圖 1B)，產物大部分富集于PEG相(圖 1C)，根據檢測處的顏色強度判斷樣品中是否含有尿素以及分析含量的高低。 

圖 1.  微流控雙水相液滴尿素檢測機理圖

 實驗部分

1   試劑和儀器

Dex(5.0×105), 脲酶(20 KU), PEG(Mw=8000), Sigma-Aldrich中國；中性紅，尿素，無水乙醇，丙酮，氯化鉀，以上試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠；環氧樹脂AB膠；去離子水。

生物顯微鏡；DDS-12DW型電導率儀；微通道注射泵；IXUS 60型數碼照相機；ST-1/NS型尿素測定儀；TGL-16型高速冷凍離心機；Color squid型磁力攪拌器；FA2204N型電子天平；OB-128型旋轉攪拌器；水浴恒溫振蕩器；硼硅玻璃毛細管；一次性注射器；P-97型拉針儀；ZYCGF-Ⅱ-10/20T型超純水機。

2   雙水相液滴流產生方法

1   微裝置的設計與制作

基于酶促反應的微流控雙水相液滴流是通過微流控裝置產生的，該裝置由玻璃毛細管和連接針頭制成。采用不銹鋼鉆頭對連接針口底部進行打孔，外管內徑為1 mm，外徑為1.2 mm。內管內徑為0.55 mm，外徑為1.0 mm。用拉針儀使內管一端口徑變小，能夠在微流控裝置中產生微小液滴，利用砂紙將圓形毛細管針頭打磨平整。利用載玻片作為裝置基底，將玻璃毛細管和針頭按圖 1組裝好，用全透明環氧樹脂AB膠固定密封。

2   雙水相的制備

雙水相是由質量分數為8%的Dex和8%的PEG分別溶于去離子水混合而成，磁力攪拌3 h充分混合后靜置12 h使其相分離。上層為PEG相，下層為Dex相。

3   雙水相液滴流的產生

液體通過聚乙烯管連接到由注射泵控制的注射器。PEG相和Dex相分別作為內、外相泵入微流控裝置中，在通道內形成PEG/Dex液滴流。

4   酶促反應平臺性能測定

4.1   雙水相液滴流中的酶促反應顯色實驗

包含脲酶的Dex溶液從外相入口進入，包含尿素和中性紅的PEG溶液從內相入口進入，微通道中的雙水相液滴形成并穩定后，通過顯微鏡鏡頭拍攝，記錄微通道中液滴反應，追蹤液滴反應中變色現象。

4.2   雙水相液滴流中的酶促反應效率測定

為了獲得脲酶反應的反應速率及轉化率，用螺口玻璃瓶在微通道的末端收集，利用電導率儀檢測收集液的電導率，空白樣品為不加入尿素的雙水相液滴流。在除去空白樣品的電導率后，通過標準曲線(電導率對應碳酸銨濃度)確定產物碳酸銨的濃度值，再通過式(1)、(2)和(3)計算碳酸銨的反應速率vP(μmol/(mL ·s))、停留時間τ(s)和轉化率Conversion(%)。

式中，L是微通道的長度(mm)，vD是液滴的流速(mm/s)，液滴的流速我們通過高清攝像頭捕捉到的畫面進行計算得出，cs和cp分別是底物和產物的濃度(μmol/mL)，轉化率代表底物尿素被脲酶催化生成碳酸銨的轉化率。

4.3   酶促反應速率在微流控雙水相液滴流和燒杯中的比較

為了比較微液滴和傳統燒杯之間的雙水相酶促反應的差異，研究了兩種體系下反應速率的差異。我們對比了在燒杯中的攪拌和靜置兩種體系的反應速率，將含有脲酶的Dex相倒入兩個燒杯中。然后，將含尿素的PEG相用注射器緩慢地分別加入兩個燒杯中Dex相的頂部，在其中一個燒杯中磁力攪拌(100 r/min)Dex相，另一個燒杯中保持靜止狀態。500 s后，測定酶促反應速率。

5  尿素檢測及應用于土壤測定

為了探究該平臺在檢測尿素的應用，進行了不同尿素濃度下測定液滴顏色強度的實驗。不同尿素濃度下，各相流量保證一致，酶質量濃度為1 mg/mL，中性紅質量濃度為0.2 mg/mL。在避光條件下，在距離錐口1 cm處標記位置拍攝液滴照片，使用Image Pro Plus 6.0軟件對液滴顏色強度進行分析。

取5 g土壤樣本，使用氯化鉀浸提劑將土壤中的氨氮浸漬出來。加25 mL質量分數為7.4%氯化鉀溶液，混合均勻后，用震蕩器震蕩30 min。取10 mL浸漬液于15 mL離心管中，用離心機離心10 min，轉速為3000 r/min。取上清液各2 mL，分別記為樣品A和B[22]。樣品A使用本微流控方法，將2 mL上清液稀釋至10 mL后，再加入PEG，配制成質量分數為8%的PEG水溶液作為待測樣品備用，進行微流控測定。樣品B使用尿素測定儀法。分別進行3次重復測定，記錄檢測結果并進行對比。

 結果與討論

1   雙水相液滴的生成

微流控裝置實物已在圖 2A中展示，外管內徑在1000 μm左右(圖 2B)，毛細錐口的直徑不到100 μm(圖 2C)。圖 2D為微流控裝置的產生液滴流的性能測試，可以看到，當流量恒定時，微通道內可以產生大小均一且間距一定的雙水相液滴。

圖 2.  微流控裝置的雙水相液滴流

2   微通道中的酶促反應

中性紅染色液滴探究酶促反應實驗如圖 3所示，圖 3A為0 s時的液滴顏色，圖 3B為5 s時的液滴顏色，圖 3C為10 s時的液滴顏色，圖 3D為20 s時的液滴顏色，圖 3E、3F、3G和3H分別為對應液滴的放大圖。隨著液滴在微通道中運動時間的增加，液滴內指示劑中性紅由紅色變為黃色。這是因為反應前液滴內物質呈中性，指示劑為紅色，反應后的產物碳酸銨為弱堿性，可使指示劑變為黃色。證明該體系下發生了酶促反應。

圖 3.  中性紅染色的PEG液滴在微通道中的變色過程

3   平均液滴直徑對酶促反應的影響

不同液滴直徑對酶促反應速率及轉化率的影響如圖 4所示。隨著液滴直徑的增大，酶反應速率(圖 4A)和轉化率(圖 4B)會逐漸降低。這主要是由于，隨著液滴直徑增大，液滴的比表面積減小，液滴界面上的物質交換的幾率降低，酶與底物傳質速度開始降低，反應速率降低。轉化率與反應速率的趨勢一致，因為在相同時間下，轉化率是由界面反應速率決定的。因此在相同流量、溶液濃度下，液滴直徑越大，轉化效率越低。后續分析檢測，為了便于測量液滴顏色強度，選擇了較大液滴直徑550 μm。若實際分析測量液滴直徑較小時，考慮到酶促反應速度較快，可將標記位置前移。

圖 4.  平均液滴直徑對酶反應速率(A)及轉化率(B)的影響

4   酶促反應速率在微流控雙水相液滴流和燒杯中的比較

本實驗研究了微流控雙水相液滴流和燒杯中酶促反應速率差異，如圖 5所示，微流控雙水相液滴流反應速率分別比沒有攪拌和輕微攪拌的燒杯ATPS中的高約1087倍和700倍。產生差異的原因主要是液滴流比傳統燒杯反應擁有更大的比表面積，更快的表面更新速率，并且液滴在流動狀態下也增強了底物與酶的接觸幾率。本實驗體系反應速度快的特點尤其適合于需要快速分析檢測的場合。

圖 5.  酶反應速率在液滴流和燒杯的比較

5   尿素檢測方法的建立及應用于土壤中尿素的測定

為了將基于酶促反應的微流控雙水相液滴流平臺應用于尿素的分析檢測，我們使用顯微鏡攝像頭拍攝1 cm處標記位置液滴的照片，通過Image-Pro Plus 6.0軟件對照片進行分析。由圖 6可知，液滴紅色強度隨底物濃度的增加而減小。本實驗測定液滴內紅色強度，所以底物濃度越高，反應速率越快，生成產物越多，指示劑中性紅由紅色變為黃色越明顯，紅色的強度就越小。對于未知濃度尿素樣品的檢測可通過表 1，得出樣品中的尿素濃度。

圖 6.  尿素濃度對液滴顏色強度的影響

使用本微流控方法和尿素測定儀法分別對土壤中尿素進行平行測定。結果表明，(微流控方法)樣品A液滴顏色強度為0.216。對比表 1，可得出結論樣品中含有尿素且尿素質量濃度范圍為0~0.5 mg/mL；(尿素測定儀法)樣品B通過尿素測定儀得出的尿素質量濃度為0.008 mg/mL，與本研究方法結果一致，也證明本研究方法不受土壤中其他含氮化合物影響。

結論

本文構建了一個基于酶促反應的微流控雙水相液滴流平臺用于簡便快捷的尿素檢測。通過對中性紅指示劑標記的液滴紅色強度進行分析，實現了尿素濃度的可視化檢測，檢測范圍為0~50 mg/mL，大大超過了市售儀器和試紙的檢測范圍。利用微液滴極大的比表面積和微米級的擴散距離進行酶促反應，其反應速率相比于傳統燒杯實驗顯著提高，同時尿素檢測時間縮短為20 s左右。雙水相體系的使用，克服了傳統油水分析檢測平臺生物相容性低的局限。我們期望該平臺在日用化學品、農業土壤、水質、食品等分析檢測領域得到廣泛的應用。

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