摘 要 適配體(Aptamer)是通過指數富集的配體系統進化技術( SELEX)篩選得到的,可與靶標分子以高親和力特異性結合的單鏈 DNA 或 RNA,在生物分離分析、臨床診斷和疾病靶向治療等領域應用廣泛。 適配體的發展與篩選技術的進步密切相關,以 SELEX 為基礎,研究者開發了磁珠 SELEX 和毛細管電泳 SELEX 等多種適配體體外篩選技術,但這些方法存在篩選輪次多、篩選周期長和樣品消耗量大、對小分子篩選效率低等缺點。 微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點,基于微流控芯片的 SELEX 技術在一定程度上可解決上述問題,實現適配體快速、高通量的體外篩選。 本文在總結 SELEX 及其關鍵技術要點的基礎上,重點評述了基于微流控和微陣列芯片 SELEX 技術的研究進展,并對 SELEX 技術中未來的發展方向進行了總結和展望。

適配體 是 通 過 指 數 富 集 的 配 體 系 統 進 化 技 術 ( Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)在體外篩選得到的一段寡聚核糖核苷酸(RNA)或單鏈脫氧核糖核苷酸(ssDNA)序列,與靶標分子之間具有特異性相互作用,借助范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用等分子間作用力,折疊成復雜穩定的 3D 結構,如莖環、發夾和 G 四鏈體等。自 1990 年 Ellington和 Tuerk從含有 10¹⁵種寡核苷酸文庫中篩選出 RNA 適配體以來,研究者陸續篩選出許多適配體,其靶標范圍覆蓋了金屬離子、三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸等小分子物質; 生長因子和細胞粘附分子等蛋白質以及其它大分子有機物,甚至可通過靶向特定的膜蛋白識別病毒、細菌和細胞。 目前,適配體已被廣泛用于靶向藥物遞送、生物分子識別和檢測[7]等領域,并已嘗試用于臨床治療方面。

適配體與靶標分子的親和力可達 mmol / L ~ pmol / L 級別,與抗體水平相當。 適配體具有抗體不能比擬的優勢,如更高的選擇性和穩定性、制備簡單、易修飾、無免疫原性等,因此受到研究者關注。

適配體的發展與篩選技術的進步密切相關。 研究者根據 SELEX 的關鍵技術要點對傳統篩選技術進行了改良,如依據結合與未結合寡核苷酸的分離技術,提出了基于磁珠分離法的 SELEX 技術和基于毛細管電泳分離法的 SELEX 技術等;提出了基于不對稱 PCR 法、入核酸外切酶法和磁珠法的次級文庫制備技術。 但是,SELEX 技術仍存在篩選輪次多、篩選周期長、文庫合成量大、利用率低、樣品消耗量大等問題。 微流控芯片具有體積小、高通量和易集成等特點,基于微流控芯片的 SELEX 技術在一定程度上可解決上述問題,為實現適配體快速、高通量的體外篩選提供了新思路。本文依據近年來適配體篩選技術的研究進展,在總結 SELEX 及其關鍵技術要點的基礎之上,重點評述了基于微流控芯片和微陣列芯片 SELEX 技術的研究進展。

微流控芯片概念及特點

微流控芯片又稱為微全分析系統,是由 Manz 等在 20 世紀 90 年代首次提出并發展起來的跨學科分析技術。 通過微加工技術,在硅、玻璃或有機聚合物基質上構建流體微通道、反應微腔室和儲液池等微結構單元,將分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上,自動完成分析全過程。 微流控芯片具有集成化、小型化、自動化等特點,以及樣品和試劑消耗量少、反應速度快、可大量平行處理等優點,在生物、化學和醫學等領域表現出巨大的發展潛力。 目前,微流控芯片技術已被廣泛用于細胞培養、基因擴增與分析和蛋白質檢測等領域。

基于微流控芯片的 SELEX 技術是近年發展起來的一種快速高效的適配體篩選體系。 將微流控芯片與 SELEX 技術結合,可將樣品和試劑的消耗量降至微升級,大大降低了篩選成本, 提升了分析速度和準確性。 目前,已發展的微流控芯片 SELEX 技術主要包括磁珠法和溶膠-凝膠法等。

微流控芯片 SELEX 技術篩選適配體

基于磁珠的微流控 SELEX 技術 基于磁珠的微流控 SELEX 技術主要包括連續流磁激活分離芯片(Continuous-flow magnetic activated chip-based separation, CMACS) 系統和微磁分離(Micro magnetseparation, MMS)系統。

Soh 研究組 利用 CMACS 系統,通過芯片連續流磁分離對重組 A 型肉毒桿菌神經毒素輕鏈的適配體進行篩選(圖 1)。 首先,通過 PCR 擴增制備 DNA 文庫,并通過 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)介導法將靶標分子固定在磁珠上; 然后,將 DNA 文庫與固定有靶標分子的磁珠共同孵育,在CMACS 芯片上進行連續洗滌; 最后,用生物素化的反義引物進行 PCR 擴增,通過磁珠法制備次級文庫,并測定其親和力。

圖 1 基于連續連續流磁激活芯片(CMACS)系統的 SELEX 過程示意圖

然而,CMACS 系統使用過程會出現微氣泡導致的氣流扭曲,以及微通道阻塞導致的磁珠聚集等問題,影響適配體的純度和回收率。 在后續的研究中,Soh 研究組開發了 MMS 系統(圖 2),將鐵磁材料整合到微通道中,通過芯片中鎳材料和緩沖液間磁導率的相對差異,實現對通道內流體動力和磁致動力的精確控制,減少了磁珠和適配體候選物的損失,實現了較高的分子分配效率。

圖 2 基于微磁分離系統的 SELEX 過程示意圖

Huang 等在 MMS 芯片的基礎上,將反應池、分離通道和微加熱系統整合到一塊芯片上,成功篩選出 C 反應蛋白的適配體,與傳統 SELEX 技術相比,基于微流控芯片的 SELEX 技術在單輪篩選時間和樣品消耗量上均大大降低。

Ahmad 等利用 MMS 芯片高效的捕獲能力和可高流速洗滌的特點,成功篩選出 3 種蛋白質的適配體:人血小板衍生生長因子 BB(Kd = 0. 028 nmol / L)、凝血酶(Kd = 0. 33 nmol / L)和載脂蛋白 E3(Kd =3. 1 nmol / L)。 通過低濃度蛋白篩選和高流速、長時間洗滌,降低了非特異性吸附和弱結合的情況,獲得了與文獻不同的人血小板衍生生長因子 BB 和凝血酶的適配體序列,而且親和力也有了較大程度的提升。研究人員還發現適配體的親和力受蛋白質帶電狀態的影響,由人血小板衍生生長因子 BB在不同 pH 條件下的篩選結果發現,在酸性緩沖液中,其與適配體具有更高的親和力。

Stoltenburg 等使用常規磁珠 SELEX 技術經 13 輪篩選得到鏈霉親和素的適配體,其解離常數約為 56 ~ 86 nmol / L。 而使用 MMS 系統經 3 輪分離后即得到了解離常數在 25 ~ 65 nmol / L 之間的適配體。 由此可見,基于微流控芯片的微磁分離 SELEX 技術比常規的磁珠 SELEX 技術更高效。

基于溶膠-凝膠的微流控 SELEX 技術

溶膠-凝膠是用含高化學活性的化合物作為前體,在液相下均勻混合并進行水解、縮合等反應,形成穩定的透明溶膠體系,經過膠粒間緩慢聚合,形成三維空間網絡結構的凝膠。 凝膠經過干燥、燒結、固化,制備出納米乃至亞納米結構的材料。通過溶膠-凝膠及其衍生物材料固定蛋白質,無需親和試劑標記,加入硅酸鹽可最大程度地保持蛋白質的生物活性,且可長期保存不失活。 此外,溶膠-凝膠材料價格相對便宜,與芯片底板材料性質相近,具有極好的相容性。 這些特點為溶膠-凝膠在微流控芯片上的應用和這一類型芯片的大規模生產奠定了基礎。

基于溶膠-凝膠的微流控 SELEX 技術中,靶標分子包裹于具有多孔納米結構的硅酸鹽水凝膠中,寡核苷酸進入納米孔與靶標分子結合。 因此,溶膠-凝膠顆粒的加工工藝極為關鍵。 首先,溶膠-凝膠基質中納米孔結構的尺寸必須與靶標分子匹配; 其次,溶膠-凝膠顆粒須在點樣后長時間穩定存在,并且有足夠強的粘附力,以防洗滌過程中顆粒丟失; 最后,每個顆粒的形態與尺寸必須統一,這對采用計算機自動分析實驗結果至關重要。

Ahn 等在芯片上集成溶膠-凝膠腔室和微加熱器等結構單元,用于文庫的洗脫和篩選(圖 3)。 該芯片帶有一組鋁電極、5 個相連的六邊形腔室和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)微通道,各腔室靶標分子競爭性結合寡核苷酸鏈。 每個腔室內單個溶膠-凝膠顆粒的體積約為 7 nL,每個顆粒可容納 30 fmol 蛋白質。 將該技術用于酵母 TATA 結合蛋白和幾種同源蛋白質的適配體篩選,僅經過 6 輪篩選, 得到了解離常數為 2. 7 nmol / L 的 TATA 結合蛋白的適配體。

圖 3 基于溶膠-凝膠的微流控芯片 SELEX 技術原理示意圖:(A) 溶膠-凝膠微流體裝置的尺寸;(B)SELEX-on-a-chip 設備的總體示意圖

小分子適配體的體外篩選工作極具挑戰性,一是因為小分子難以固定; 二是受小分子本身結合位點數的限制,篩選出的適配體與小分子的結合也會受到影響。 通過改變溶膠-凝膠顆粒孔徑的尺寸,可很好地實現小分子靶標的固定。 Bae 等加工了具有納米孔徑和微米通道的溶膠-凝膠顆粒,寡核苷酸可在微米通道內自由移動,但與小分子靶標相互作用后,被截留在溶膠-凝膠顆粒中。 通過基于溶膠-凝膠法的微流控 SELEX 技術,采用 7 輪篩選得到了黃嘌呤的適配體,解離常數為 4. 2 滋mol / L。

微流控芯片與 SELEX 技術結合,提高了適配體的篩選效率,降低了篩選成本。 但是,基于微流控芯片的適配體篩選技術在流體流動過程中常會產生氣泡,對靶標分子與適配體的識別,以及后續的PCR 擴增等均會產生影響。

免責聲明：文章來源網絡  以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。 轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除。