建立了一種新的基于微流控液滴形成技術(shù)的聚乙烯醇(Poly(vinylalcohol)，PVA)微球制備方法。在微流控芯片上利用液滴形成技術(shù)可以快速、連續(xù)產(chǎn)生尺度均一、單分散性好的PVA液滴。液滴制備速度可以達(dá)到7個(gè)/s。并且通過(guò)改變制備液中兩相流體的注入流量和微流控通道寬度可對(duì)生成的PVA液滴的尺寸進(jìn)行調(diào)節(jié)。將收集得到的PVA液滴進(jìn)行物理交聯(lián)固化處理，可以獲得大量尺寸均一的聚乙烯醇微球。本方法制備效率高，所得到的微球單分散效果好，而且微球形成不需要化學(xué)交聯(lián)劑的摻入，避免了對(duì)包載物質(zhì)的干擾，非常適合藥物載體等應(yīng)用。

1引言

藥物載體是一種可以改變藥物進(jìn)入人體的方式、控制其在體內(nèi)的分布和釋放速度并將其輸送到靶向器官的體系，很多新型的藥物載體釋放和靶向系統(tǒng)能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度，因而相關(guān)研究受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

現(xiàn)有藥物載體的研究主要集中在微粒、脂質(zhì)體、凍干粉、復(fù)乳及凝膠、納米材料等新型輸送系統(tǒng)。把藥物溶解或者分散在高分子材料基質(zhì)所形成的微小球狀實(shí)體(微?；蛭⑶?中就可以實(shí)現(xiàn)微粒載體的包載。包載藥物的微粒通過(guò)特定表面修飾，在注入機(jī)體后，可對(duì)特定器官和組織起靶向識(shí)別作用。同時(shí)，微球中的藥物的釋放可以通過(guò)調(diào)控藥物溶解度、物理狀態(tài)、藥物-微球親和力等因素來(lái)調(diào)節(jié)，達(dá)到可控緩釋等目的。其中，基于聚乙二醇-聚乳酸共聚物(PELA)、殼聚糖、海藻酸鈉等材料的微粒藥物載體由于制備難度較低、物化性質(zhì)穩(wěn)定、包封率和保護(hù)率較高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。但是，這些微粒載體制備方法仍存在有機(jī)溶媒殘余量大、殘留溶劑毒性大、工藝復(fù)雜、操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、藥物穩(wěn)定性易破壞等問(wèn)題。因此，尋求新的藥物微粒載體制備方法仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

相對(duì)于其它藥物載體材料，聚乙烯醇(PVA)具有良好的生物相容性和親水性，在生物體內(nèi)能夠緩慢降解;并且PVA材料無(wú)毒、價(jià)格低廉、來(lái)源豐富，因而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。基于PVA的微粒(微球)常被用作藥物載體和血管栓塞劑。

目前，PVA微球制備常采用乳化交聯(lián)、輻射交聯(lián)和物理交聯(lián)等方法。乳化交聯(lián)是將作為分散相的PVA溶液與連續(xù)相混合，在一定溫度下攪拌乳化一定時(shí)間后，再加入交聯(lián)劑和催化劑攪拌，即可得到交聯(lián)固化的PVA微球。該方法制作微球時(shí)，水相和油相混合攪拌乳化形成的PVA液滴大小不均，且尺寸很難控制，固化后得到的微球分散性差且形態(tài)也不規(guī)則。輻射交聯(lián)是使用高能射線(如γ射線)對(duì)PVA溶液進(jìn)行照射，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)固化的方法，這種方式實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)較難，并且操作要求比較高。物理交聯(lián)常采用分散相注射滴加的方式在大量溶液中形成PVA液滴，然后利用冷凍-解凍方法使PVA液滴固化形成微球。該方法形成的微球分散性較普通乳化交聯(lián)法有了較大改善，而且也避免了交聯(lián)劑和催化劑的殘留。但是，這一方法所得到的微球通常尺寸較大(～1mm)，難以滿足大多數(shù)的載藥要求。

微流控液滴形成技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的微流控技術(shù)，可以在微流控通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)液滴生成和液滴操作。該技術(shù)需要被制備成液滴的分散相和連續(xù)相在通道內(nèi)通過(guò)連續(xù)的相互作用生成液滴。微流控芯片上生成得到的液滴單分散性好，制備過(guò)程可實(shí)時(shí)觀測(cè)分析，通過(guò)調(diào)節(jié)芯片液相的注入流量，可控制液滴的生成速率和大小。同時(shí)，通過(guò)設(shè)計(jì)通道結(jié)構(gòu)和尺寸，也可以對(duì)液滴尺寸進(jìn)行控制。本研究利用微流控液滴形成技術(shù)制備PVA液滴，所獲得的PVA液滴不需要額外的收集過(guò)程即可進(jìn)行物理交聯(lián)固化，通過(guò)冷凍-解凍方法使PVA液滴固化獲得凝膠微球。

2實(shí)驗(yàn)部分

2．1儀器與試劑

ＲDT高速攝像儀；AE31顯微鏡；B-95504微泵；101-233數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；PDC-MG等離子清洗儀；DZF-6050真空干燥箱；HH2K2水浴鍋。

司盤80；聚乙烯醇；二甲基硅油；聚二甲基硅氧烷。

2．2芯片設(shè)計(jì)及加工

使用AutoCAD制圖軟件繪制芯片的通道結(jié)構(gòu)(圖1A)，前端兩條進(jìn)樣支路的夾角為135°，中間通道為不同曲折程度的蛇形通道，蛇形通道末端接長(zhǎng)方形收集池結(jié)構(gòu)。其中，進(jìn)樣支路和中間蛇形結(jié)構(gòu)的通道寬度相同。

圖1(A)芯片結(jié)構(gòu)示意圖;(B)制備的微流控芯片照片F(xiàn)ig．1(A)Diagramofchipstructure;(B)Photooffabricatedmicrofluidicchip的通道寬度相同。

采用軟光刻工藝制備SU-8陽(yáng)模。將適量PDMS前聚體與固化劑按10∶1的比例攪拌混合均勻，抽真空除去氣泡，然后澆于培養(yǎng)皿內(nèi)的模板上，厚度約為0．5cm。把培養(yǎng)皿水平放在75℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)固化1h后取出。從模板上揭下固化的PDMS膠塊，用打孔器在微通道進(jìn)樣孔的位置打通孔，用手術(shù)刀切出收集池。將PDMS和載玻片的待鍵合面朝上放入等離子清洗儀中清洗2min后取出，將處理后的兩面鍵合在一起。在進(jìn)出樣孔上插入聚四氟乙烯導(dǎo)管，并用PDMS膠封合，再次于75℃固化，即可得到芯片(圖1B)。將芯片置于顯微鏡觀察平臺(tái)，并將導(dǎo)管與微量注射泵連接，即完成實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的搭建。

2．3實(shí)驗(yàn)方法

2．3．1PVA溶液的配制

精密稱取PVA-1799(聚合度1700，醇解度99%)2．5g，蒸餾水47．5g，加入到錐形瓶中90℃水浴3h，待PVA完全溶解后，即配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的PVA溶液。為了減少水浴過(guò)程中錐形瓶中的水分蒸發(fā)，錐形瓶用保鮮膜封口。

2．3．2連續(xù)相配制

將3mL表面活性劑Sapn-80加入到97mL二甲基硅油中，超聲振蕩，使Span-80完全溶解于硅油中，即得到表面活性劑體積分?jǐn)?shù)為3%的連續(xù)相。

2．3．3液滴制備

在兩個(gè)不同微量泵的注射器中分別吸取0．5mLPVA溶液和二甲基硅油，通過(guò)導(dǎo)管與浸潤(rùn)好芯片的分散相及連續(xù)相入口孔相連接。將芯片置于顯微鏡的載物臺(tái)上(圖2A)，調(diào)節(jié)兩相液體的進(jìn)樣流量，觀察并記錄液滴的形成情況(圖2B)。

2．3．4液滴的物理交聯(lián)

待液滴穩(wěn)定生成后，對(duì)芯片收集腔室收集到的液滴進(jìn)行固化處理。將芯片置于!80℃冷凍12h再室溫解凍8h，重復(fù)冷凍-解凍過(guò)程3次，即可得到固化的PVA微球。

3結(jié)果與討論

3．1通道結(jié)構(gòu)對(duì)PVA液滴形成的影響

3．1．1蛇形通道

液相從兩側(cè)支路匯入交叉口之后，當(dāng)芯片后端不接蛇形通道時(shí)，單直通道形成的后端流阻較小，連續(xù)相對(duì)分散相的作用力表現(xiàn)為水平加速其向后端流動(dòng)的效果，而垂直的剪切力不足以將分散相剪切成液柱或者液滴，由于連續(xù)相和分散相的油/水不溶，在通道內(nèi)形成兩相流的流動(dòng)狀態(tài)。隨著后端彎折通道的增加(4彎折→8彎折→12彎折)，Y型交叉口位置形成的積壓越來(lái)越大，連續(xù)相對(duì)分散相的剪切力也隨之增大，分散相被剪切成的液柱逐漸變短至與通道寬度接近的尺寸。圖3是在相同的芯片通道寬度，通道浸潤(rùn)時(shí)間和同一組進(jìn)樣速率條件下(分散相50#L/h，連續(xù)相100#L/h)，不同的蛇形通道長(zhǎng)度(彎折通道數(shù))的芯片在交叉口形成液滴的情況。

圖2(A)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)裝置;(B)液滴穩(wěn)定生成Fig．2(A)Experimentalsystem;(B)Stableproductionofthedroplet

圖3(A)0彎折通道形成兩相流;(B)4彎折通道形成長(zhǎng)液柱;(C)8彎折通道，液滴大小接近通道寬度;(D)12彎折通道，液滴大小接近通道寬度，但穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)Fig．3(A)0bendchanneltoformatwo-phaseflow;(B)4bendchannelstoformalongliquidcolumn;(C)8bendchannels，thesizeofdropletclosetochannelwidth;(D)12bendchannels，thedropletsizeclosetothechannelwidthforalongersettlingtime

芯片結(jié)構(gòu)的后面部分設(shè)計(jì)成蛇形回路形狀能夠起到穩(wěn)定通道內(nèi)壓力的作用，有利于在前方Y交叉口位置更均勻的形成液滴。蛇形通道同時(shí)也起到了延長(zhǎng)液滴在通道內(nèi)的流動(dòng)時(shí)間的作用，使得生成的液滴的形態(tài)在長(zhǎng)時(shí)間的流動(dòng)過(guò)程中更加規(guī)則。同時(shí)，液滴在彎折蛇形通道內(nèi)的流動(dòng)，方便觀察。

3．1．2通道寬度

微流控通道的寬度是影響液滴產(chǎn)生的一個(gè)重要因素，它限制了液滴的側(cè)向擴(kuò)展距離，從而決定了液滴穩(wěn)定連續(xù)生成時(shí)的最小粒徑尺寸。圖4A和圖4B中不同通道尺寸的芯片所生成的球形液滴，其直徑與產(chǎn)生它們的通道寬度基本一致。調(diào)節(jié)分散相和連續(xù)相的進(jìn)樣流量，液滴穩(wěn)定生成時(shí)的最小直徑接近通道寬度，分別為(100．86±0．69)μm和(200．71±0．76)μm(n=7，下同)。

3．2流量對(duì)液滴形成的影響

在兩相流體形成液滴的過(guò)程中，兩相流不同的流動(dòng)速度會(huì)對(duì)流體間的擠壓、剪切過(guò)程產(chǎn)生影響，從而影響液滴的形成過(guò)程。在本研究中，分散相的進(jìn)樣流量設(shè)定為15#L/h，連續(xù)相設(shè)置為10、13、15和20μL/h，20#L/h后開(kāi)始以10#L/h的梯度逐漸增加。以Y夾角交叉口作為1min內(nèi)液滴生成數(shù)量的統(tǒng)計(jì)觀察位置，使用高速攝像儀記錄1min內(nèi)不同連續(xù)相進(jìn)樣流量下生成液滴的數(shù)目情況，統(tǒng)計(jì)后計(jì)算得到單位時(shí)間內(nèi)液滴的生成速率。生成液滴的長(zhǎng)度(圖5A)和生成速率(圖5B)隨著連續(xù)相流動(dòng)速度的變化而改變。當(dāng)連續(xù)相的進(jìn)樣流量為10μL/h時(shí)，連續(xù)相與分散相匯流時(shí)所產(chǎn)生的剪切力不足以切斷分散相，從而無(wú)法形成液柱或液滴。增大連續(xù)相流量，當(dāng)流速達(dá)到13μL/h時(shí)，通道內(nèi)有長(zhǎng)液柱形成，長(zhǎng)度為(681．71±1．11)μm，單位時(shí)間內(nèi)的液滴(柱)生成數(shù)量為(3．14±0．69)個(gè)。隨著連續(xù)相流量的增大到15μL/h時(shí)，所形成液柱的平均液柱長(zhǎng)度減小為(322．43±1．51)#m，但生成頻率增大到(4．00±0．58)個(gè)/s。連續(xù)相的流量從20μL/h增加到90μL/h的8個(gè)進(jìn)樣流量下，液滴的長(zhǎng)度不斷減小，分別為(312．29±1．60)#m、(196．43±0．98)#m、(162．86±1．07)#m、(154．57±1．27)#m、(138．43±0．79)#m、(136．86±0．69)#m、(130．57±0．53)#m、(126．71±0．76)#m，單位時(shí)間內(nèi)生成液滴的數(shù)量逐漸增加，分別為4．43±0．53、5．57±0．53、5．71±0．76、5．86±0．38、6．14±0．38、6．29±0．49、6．43±0．53、6．57±0．79。當(dāng)連續(xù)相增大到100μL/h后，所形成液滴的長(zhǎng)度在100#m(通道寬度)左右微小變化，分別為(106．86±0．69)#m、(100．29±0．76)#m、(98．43±0．53)#m、(101．57±0．79)#m、(100．29±0．49)#m、(97．14±0．69)#m、(98．00±1．00)#m，此時(shí)液滴生成速度保持在7個(gè)/s，然后急劇減少，分別為6．71±0．76、6．71±0．49、6．86±0．38、7．14±0．38、5．86±0．69、2．57±0．53、0．71±0．49。當(dāng)連續(xù)相進(jìn)樣流量達(dá)到170μL/h時(shí)，通道內(nèi)沒(méi)有液滴生成。

圖4(A)100μm通道寬度生成的液滴;(B)200μm通道寬度生成的液滴Fig．4(A)Dropletproducedinthechannelof100-μmwidth;(B)Dropletproducedinthechannelof200-μmwidth

圖5(A)液滴長(zhǎng)度隨連續(xù)相變化情況;(B)液滴數(shù)量隨連續(xù)相變化情況Fig．5(A)Lengthofdropletchangeswithcontinuousflowrate;(B)Numberofdropletchangeswithcontinuousflowrate

當(dāng)分散相流量一定時(shí)，隨著連續(xù)相流量的增大，連續(xù)相進(jìn)樣支路形成的積壓壓力也逐漸增大。這個(gè)壓力形成的兩個(gè)分力(對(duì)分散相的剪切力、推動(dòng)液滴向前運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力)也隨之增大。因此，在單位時(shí)間里連續(xù)相會(huì)截取得到更多，尺寸更小的液滴，同時(shí)向前的推動(dòng)力也使液滴之間的距離增大。如繼續(xù)增大連續(xù)相的流量，剪切力分壓將會(huì)作用到分散相的進(jìn)樣支路上，從而使剪切得到的液滴數(shù)目下降，但所得到的液滴在通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)速度會(huì)加快。而當(dāng)剪切力分壓大于分散相進(jìn)樣支路壓力時(shí)，連續(xù)相進(jìn)入分散相支路通道并阻礙分散相的流動(dòng)，從而打破穩(wěn)定生成液滴時(shí)的平衡狀態(tài)。由于是恒流進(jìn)樣，受壓迫支路內(nèi)的壓力不斷累積，會(huì)再次和另一進(jìn)樣支路、蛇形通道形成穩(wěn)定狀態(tài)，而在這個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)下，液滴的大小和生成速度較上一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)將發(fā)生改變。因此，當(dāng)分散相的注入流量為15#L/h時(shí)，選擇連續(xù)相流量為130μL/h時(shí)，可以得到較好的液滴形成效果，此時(shí)液滴制備速度可以達(dá)到7個(gè)/s。

3．3液滴的物理交聯(lián)固化

微芯片中形成的PVA液滴經(jīng)微通道最終會(huì)流進(jìn)收集池中，當(dāng)收集池中收集一定數(shù)目的液滴后，連同微芯片一起置于!80℃冷凍環(huán)境下進(jìn)行快速冷凍?？焖倮鋬龇梢杂行Ы档屠鋬鲞^(guò)程中PVA液滴的形態(tài)變化程度，從而保證最終得到的微球的球形形態(tài)的規(guī)則性。PVA液滴經(jīng)過(guò)一次冷凍/解凍過(guò)程得到的凝膠微球的強(qiáng)度較低，是一個(gè)輕度物理交聯(lián)的過(guò)程，重復(fù)3次冷凍/解凍過(guò)程后的PVA凝膠微球達(dá)到了深度交聯(lián)，凝膠微球的強(qiáng)度大大高于輕度交聯(lián)的強(qiáng)度。隨著交聯(lián)程度深化，PVA聚合物的分子鏈間以及與水分子間的結(jié)合變得更加緊密，形成更多緊密的微晶區(qū)。單個(gè)PVA液滴宏觀上的變化表現(xiàn)為體積的縮小，3次交聯(lián)后的凝膠微球(圖6)的平均直徑為(84．12±1．64)μm，相比交聯(lián)前的(100．86±200滋m

圖6!80℃冷凍交聯(lián)3次后的PVA凝膠微球的電鏡圖Fig．6ScanningelectronmicroscopyimageofPVAgelmicrospheresafterthricefreezingcrosslinkingat!80℃0．69)μm(分散相15μL/h，連續(xù)相100μL/h)，直徑縮減了16．60%。

其它常用的PVA交聯(lián)固化法包括化學(xué)乳化法和輻射法。本研究采用物理交聯(lián)固化的方法，與乳化交聯(lián)法相比，由于未引入任何有毒的化學(xué)試劑，得到的PVA微球更加安全、可靠，有利于后期應(yīng)用該載體開(kāi)展靶向給藥、定點(diǎn)緩釋等領(lǐng)域的應(yīng)用研究;相比于輻射交聯(lián)法，冷凍/解凍的物理交聯(lián)法操作簡(jiǎn)便易行。

4結(jié)論

各種高聚物微球在藥物載體等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。相對(duì)于其他高聚物材料，聚乙烯醇在微球制備及應(yīng)用方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)制備方法得到的PVA微球的單分散性不佳，產(chǎn)率也較低，限制了這一材料的廣泛應(yīng)用。

本研究采用微流控液滴制備技術(shù)連續(xù)產(chǎn)生大量尺寸均一的PVA液滴，通過(guò)物理交聯(lián)固化產(chǎn)生PVA微球。結(jié)果表明，通過(guò)使用不同通道寬度的芯片或者改變連續(xù)相和分散相的注入流量可以得到不同大小的PVA液滴。本方法制備得到的PVA微球單分散性效果好;同時(shí)，可根據(jù)需要調(diào)節(jié)微流控芯片內(nèi)流動(dòng)參數(shù)制備不同粒徑大小的PVA微球，并允許對(duì)制備過(guò)程實(shí)時(shí)觀測(cè)分析和調(diào)整。有助于參數(shù)優(yōu)化和液滴制備效果的改善，相對(duì)于傳統(tǒng)大容積制備器皿，芯片的表面/容積比更大，加熱和降溫都更快，更有利于PVA液滴的物理交聯(lián)，芯片內(nèi)所集成的收集腔室等微結(jié)構(gòu)能夠富集微球，有利于收集等操作。

文獻(xiàn)來(lái)源分析化學(xué) DOI: 10．11895 /j．issn．0253-3820．181156 作者：韓縣偉 張洪武 羅洪艷等（轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，部分內(nèi)容有刪減，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）