自從1985年美國科學家Kary Mullis發明PCR方法以來，該方法已經成為生命科學研究領域中最常規的實驗方法之一。PCR方法就是在體外采用DNA聚合酶促反應來特異性合成特定核酸片段達到富集的目的。PCR擴增產物可用于下游多種應用，如克隆表達、芯片雜交、突變檢測、測序等等。
  “三代PCR的發展”從PCR技術誕生至今，PCR技術已經經過了三代更迭。區分這三代的，主要是指PCR產物的檢測方式。

第一代PCR

第一代PCR采用電泳的方式對PCR產物進行分析，主要的分析內容有：條帶大小、條帶數量、條帶濃度等。根據電泳條帶的這些信息能夠實現研究者的某些實驗目的，比如制備DNA片段、檢測目的序列、對目的基因表達進行定性分析等。第一代PCR的最大缺陷在于無法實現精確定量。一句話概括第一代PCR：看PCR產物的電泳條帶。

第二代PCR

第二代PCR即熒光定量PCR，它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測熒光的積累，借助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。但依賴于Cq值仍然是目前定量PCR最大的技術瓶頸，只有在規范的實驗流程、統一的設計思路下，得到的結果才具有可重復性和可比性。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細微的條件下，其檢測的靈敏度、精確度都受到了限制。一句話概括第二代PCR：檢測反應體系中熒光的實時變化。

第三代PCR

由于熒光定量PCR在定量方面的缺陷，第三代PCR即數字PCR應運而生，它采用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。實現這一過程的關鍵在于采用某種分散手段，使一個完整的PCR體系分散成為成千上萬個獨立的PCR體系，每個PCR體系中只包含一個或零個模板（實際每個微體系中的模板數符合泊松分布）。這樣，分別檢測這些體系是否發生了PCR反應并且進行計數，便可進行精確定量。一個詞概括數字PCR的檢測方式：

數字PCR的計量方式——化一為萬

核酸樣品的分散是數字PCR中的第一步，也是最核心的步驟。從最早期的96或384孔，到如今已經將反應體系縮小至納升或皮升級別。

理想情況下，DNA模板應該完全分散在不同的獨立反應體系內（如微孔或微滴內）。這些微小的反應體系互不干擾，儀器通過檢測每個微體系中的熒光變化來判斷里面是否有PCR反應發生，若發生，即證明體系中有模板。

目前主流的樣本分散方式有兩種：以Thermo QuantStudio? 3D數字PCR系統為代表的微流控芯片法、以及以BIO-RAD QX200?數字PCR系統為代表的微滴法。

1微流控芯片——硅板蝕刻“小房間”

QuantStudio? 3D采用了高密度的納升流控芯片技術，芯片中有多達20,000個反應孔，樣品加樣之后，會均勻分布到這些孔中，達到相互隔離的目的，PCR反應之后，計數器會讀取每個微孔中得到熒光信號并計數。

2微滴法——油包水“小房間”

BIO-RAD QX200?統結合了油包水乳化微滴技術與微流體技術，借助微滴發生器，可將每個樣品生成20000 個均一的納升級微滴，目的片段和背景序列在微滴中隨機分布，每個微滴都是一個獨立的反應器。在使用熱循環儀進行 PCR 后，QX200 微滴分析儀將逐個分析每個樣品中的液滴。微滴被吸入后，管路將分解乳化的液滴，并使它們依次通過一個雙色光學檢測系統。系統將計算陽性和陰性微滴的數量，從而以數字格式對靶 DNA 進行絕對定量分析。

以BIO-RAD QX200?數字PCR系統為例，詳細講解數字PCR的操作步驟和應用舉例。

微滴式數字PCR——簡易操作流程

以BIORAD QX200微滴式數字PCR為例，為大家講解操作流程

從流程圖中可以看出，QX200 ddPCR的簡易操作流程包括以下幾個步驟：

1制備ddPCR反應液

選用適宜的探針法預混液，振蕩混勻，離心除氣泡，注意所加樣本核酸含量不要超過規定檢測范圍(1~100000拷貝片段化核酸或者1~20000拷貝完整基因組DNA，如完整的人類基因組DNA不要超過66ng/20ul)，提前用限制性內切酶處理樣本可提高檢測濃度。另外，用質粒作為模板時建議酶切以消除復雜結構，做CNV實驗時必須對DNA模板進行高頻酶切；這樣做的目的是降低模板的粘稠度，更有利于模板的分散和微滴的形成。

2制備微滴

安裝

將8孔微滴生成板打開包裝，安裝到支架上，注意微滴生成板的方向與支架上標記方向一致。

加樣

將20ul樣品反應體系加入到微滴生成板中間一排的8個孔內，不足8個樣品時用稀釋一倍的20ul 1×buffer control 補足，不能留空。在微滴生成板最底下一排 8 個孔中各加入 70ul 微滴生成油（DG Oil，探針法與染料法用不同的生成油），同樣不能留空。

微滴生成

蓋上膠墊，注意兩邊的小孔都要鉤牢；將其輕輕地平穩放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態，一般約2分鐘即可完成。完成之后，微滴生成于板的最上面一排孔內：

3進行PCR擴增

使用移液器，小心地從微滴生成板中吸取40μl，緩慢轉移至96孔PCR板中。由于數字PCR檢測的是每個液滴中最終是否含有熒光，從而判定微滴中是否含有模板，而不是實時觀測每個液滴或每管中熒光變化的循環數，因此，使用常規的熱循環儀即可進行數字PCR擴增。擴增的參數根據引物和模板決定，不再贅述。

4讀取并分析結果

結果讀取

PCR擴增結束之后，每一孔中將有不同數量的微滴產生了熒光信號，接下來就需要讀取這些微滴，將每孔的微滴總數及含有熒光的微滴數統計出來。

將之前完成PCR的96孔板放入底座中組裝好，蓋好頂部支架，之后輕輕地平穩放入微滴讀取儀中，如圖：

微滴讀取儀將依次吸取每孔中的微滴，依次讓微滴流過檢測器進行熒光檢測，并對每一個微滴的相對熒光值進行記錄。

數據分析

設定RFU的閾值之后，通過之前講述過的泊松分布，程序將自動計算出該體系中的模板濃度（copies/μl）。

當檢測SNV基因型時，反應體系中有兩條探針(如FAM-BHQ水解探針和VIC-BHQ水解探針)，程序將根據您設定的閾值繪制二維聚類圖，從而計算出每個象限中的模板個數：

通過計算三個象限中微滴個數占總數量的比例，即可方便地計算出模板中野生純合子、突變純合子以及雜合子所占的比值。

當然，除了檢測SNV，數字PCR還有很多廣泛的用途:

數字PCR——優缺點與應用

數字PCR的優勢

得益于日益完善的“有限稀釋”技術，使得數字PCR在分析模板含量及組成方面有著無可比擬的靈敏度。相對于上一代qPCR，dPCR的優勢體現在以下幾個方面：

高檢測靈敏度

傳統的常規PCR以及熒光定量qPCR，分別通過電泳條帶染色以及擴增循環過程中熒光的增加來檢測模板DNA的含量，這兩種檢測方法決定了低拷貝數的模板難以檢測到。而數字PCR將一個傳統的PCR反應分割成了數萬個體系，這些體系獨立擴增，獨立檢測，保證了個位數的模板數量都可以被檢測到。

高定量精確度

使用qPCR進行絕對定量，需要制備反應標準品，繪制標準曲線，根據待檢樣品和標準曲線的關系進行換算，在反應和換算過程中勢必會引入極大誤差。而dPCR拋棄了標準品，通過微體系的熒光計數，直接將反應初始模板數量統計出來，即使某些微滴中的模板數量不止一個，也可以通過引入泊松分布提升其計算精確度。

高耐受性

當反應體系中有PCR抑制物存在時，常規的PCR體系經常會受到影響。而dPCR第一步反應體系的分配過程中，會導致模板和抑制物分配到不同的體系，從而顯著降低了抑制物的干擾。并且，與qPCR不同的是，dPCR檢測的是終點熒光，即使微體系稍微受到了影響，也不會影響最終結果的判讀。

數字PCR的不足

1.模板添加量要求較高

正是由于數字PCR將反應拆分成了數萬個獨立體系，因此其對模板量有比較高的要求，如果模板量飽和，超過了微體系的數量，那么每個微滴都將有信號，無法進行定量；反之，如果模板量太少，僅有幾個微滴產生熒光信號，勢必也降低了定量的準確性。因此，進行dPCR之前，需要摸索模板的添加量，將模板稀釋到合適的濃度，如同qPCR預實驗需進行梯度稀釋找到合適的Cq值時的模板濃度一樣。

2.非特異性產物的判斷

不同于常規PCR和qPCR，可以分別通過電泳條帶和熔解曲線觀測特異性，數字PCR觀測的是每個體系中的終點熒光，無論PCR產物是否是特異性產物，只要熒光信號足夠強，也是會判讀為陽性結果。因此dPCR的引物特異性要求極高，并且十分推薦采用特異性高的探針法而非染料法進行實驗。

針對上述兩個問題，通常進行dPCR之前，需要先進行qPCR，根據Cq值來確定模板的稀釋倍數，并通過熔解曲線進行擴增特異性的判斷。

數字PCR的應用

痕量核酸檢測

dPCR尤其適合對靈敏度要求非常高的核酸痕量分析研究，如環境水樣的微生物檢測等。在癌癥低頻突變檢測方面，在一份給定的樣本中，相比于野生型DNA，癌癥相關的突變序列比例較低，經常無法檢測。而憑借其超高靈敏度，dPCR系統可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突變頻率。突破了其他方法的局限性。使用數字PCR技術，研究人員現在能夠實現對突變位點更細微的定量分析，更好地明確其在癌癥中的相關作用。

BRAF是人類最重要的原癌基因之一,大約8%的人類腫瘤發生BRAF突變。BRAF的絕大部分突變形式為BRAF V600E突變, 主要發生于黑色素瘤、結腸癌和甲狀腺癌中。該突變導致下游MEK-ERK信號通路持續激活,對腫瘤的生長增殖和侵襲轉移至關重要, 是抗黑色素瘤等V600E突變腫瘤的有效作用靶標之一。dPCR系統的高靈敏度可以確保對野生型DNA背景下的BRAF V600E突變進行精確的定量分析。

洞察病毒載量

精確的病毒載量分析對于闡釋疾病病程，后續治療及療效評估是至關重要的。病毒載量的波動，即使只下降了非常低的水平，意義卻是顯著的。在對病原體的研究中，能否實現準確而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，關系到實驗的成敗。

研究人員比較了qPCR和dPCR方法檢測臨床樣本中殘留的人類免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染嬰兒。研究人員發現，在檢測百萬個細胞內的HIV DNA拷貝數時，相比于qPCR，dPCR的靈敏度提升了5倍；在檢測病毒長末端重復序列時，dPCR比qPCR靈敏提升了20倍。

區分基因組變異

在人類基因組中，拷貝數變異（CNV）是個體差異的一個重要來源。CNV與癌癥，神經系統和自身免疫性疾病，藥物不良反應有密切的關系?？煽康刈R別這類CNVs是開創性研究的一項重要手段。

拷貝數（CN）評估的主要技術瓶頸是如何在統計置信度下有效區分連續的CN。從根本上說，隨著CN增加，目標遺傳物質之間的差異百分比下降，這使得CNV的檢測更加困難。dPCR系統通過在成千上萬個微滴中進行CNV特定片段的擴增反應，實現在卓越的統計置信度下，對更高連續拷貝數（例如5拷貝和6拷貝）的區分。

Bharuthram等按照標準方法分別使用qPCR和dPCR對CCL4L基因拷貝數進行評估測定。研究表明，與qPCR(r=0.87，P<0.0001)相比，由dPCR測得CCL4L拷貝與CCL4L1和CCL4L2拷貝之和具有良好的相關性(r=0.99，P<0.0001)。而qPCR在高拷貝數時出現準確性明顯下降。

NGS驗證及文庫定量

dPCR平臺可以方便地與下一代測序（NGS）文庫制備流程對接，精確定量測序文庫。 除了精確量化，QX200 系統所得到的結果包含測序文庫的定性信息，這是當前其他方法所不具備的。這確保了文庫上樣量的一致性，提高NGS的使用效率與成功率。NGS運行結束后，dPCR還能對NGS的結果進行驗證，諸如單核苷酸多態性，突變及拷貝數變異在內的基因組變異。

圖表顯示dPCR與MiSeq實驗結果的比較。對于上樣量100ng總RNA的低豐度轉錄子（TBP和GUSB基因），ddPCR檢測的拷貝數為幾千個copies/孔，這表明dPCR提高了檢測靈敏度。而MiSeq測序在每千堿基每百萬讀長（RPKM）中只檢測到個位數的記錄。相比于RNA測序，ddPCR在擴增過程無偏差，且靈敏度提高了1000倍以上。

憑借簡便、可靠的特點，數字PCR已經在癌癥分子標志物的發現，傳染病研究，基因組結構變異分析，基因表達分析等領域展現出了強大的優勢。但這僅僅是一個開始，隨著數字PCR的日益完善和改進，該技術將廣泛應用于醫療檢測、食品、環境農林領域的各個方面。

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