基于時間分辨免疫分析的冰毒檢測微流控芯片
研制了一種聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)-多聚賴氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片雜合微流控芯片,每張芯片有24條反應通道,每條反應通道體積僅為2.5微升,實現了基于時間分辨免疫分析技術的高通量冰毒(Methamphetamine,MET)定量檢測。此芯片利用PDMS和PLL對蛋白質的吸附特性在反應通道內表面固定冰毒完全抗原(MET-BSA),使其與待測樣品中的冰毒抗原(MET-Ag)共同競爭標記有冰毒抗體(MET-Ab)的乳膠微球。乳膠微球表面標記了鑭系元素,在紫外光的照射下會發出紅色熒光,根據競爭法檢測原理,冰毒濃度越高,與反應通道內表面冰毒完全抗原結合的乳膠微球數量越少,所發出熒光強度越低。本芯片的結果讀取采用紫外照射熒光成像方法,僅需對芯片拍攝熒光圖像,即可實現24個樣本的同時檢測分析。本方法樣品消耗量少,通量大,可以在100~3000ng/mL濃度范圍內實現對冰毒的定量檢測,可用于緝毒的初步篩查,具有較好的應用前景。
1引言
冰毒,即甲基苯丙胺,又名甲基安非他命(Methamphetamine,MET),在大部分地區已經趕超海洛因,僅次于大麻,成為最主要的涉案毒品種類,可致人成癮,長期服用會損壞服用者認知,導致精神混亂、器官衰竭,不僅危害個人健康,還嚴重危害社會治安。人吸食冰毒后,約43%未降解的原藥會在尿液排泄出來,在尿液中可檢出甲基安非他命、安非他命、對羥基甲基安非他命、對羥基安非他命,冰毒濫用者服用純品冰毒后,24h內尿中冰毒濃度均超過1000ng/mL。目前,在緝毒領域,檢測冰毒的膠體金免疫檢測測試卡靈敏度為1000ng/mL,如果吸毒者吸食的是混合毒品,則其尿液中冰毒的含量會降低,使用膠體金測試卡可能出現漏檢的情況[4,5]。高效液相色譜法和氣相色譜-質譜聯用分析法準確且重復性好,是檢測冰毒的最終確認方法,但是檢測儀器昂貴且操作復雜,不適合初步的大量樣品篩查使用。其它毒品檢測的方法,包括化學顯色法、色譜-質譜法、色譜-光譜法、毛細管電泳法等,比較依賴大型儀器,或難以實現高通量測定。因此,需要建立新的冰毒檢測方法,以滿足簡單、高通量、快速的現場檢測需求。時間分辨免疫熒光技術具有較高的分析靈敏度,微流控芯片技術易于實現高通量檢測且操作簡單,將兩種技術結合起來可望實現便捷的高通量冰毒檢測。
標記免疫分析是標記技術與免疫分析技術相結合的一種分析測定技術,自1959年使用放射性同位素為標記物以來,各種新型標記物不斷出現,如以酶為標記物的酶標免疫分析、以膠體金為標記物的膠體金免疫分析、以化學發光底物為標記物的化學發光免疫分析、以電化學為基礎的電化學發光免疫分析,還有以鑭系稀土元素為標記物的時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)等。其中常用于TRFIA的元素有鑭系元素銪、釤、鋱和鏑及其螯合物,相比于傳統的酶、膠體金、化學發光底物等標記物,具有較大的Stokes位移,熒光強度高,半衰期長,激發光譜較寬,而發射光譜很窄,此外,它還具有制備簡便、無放射性污染、可重復激發測量等優越性,在臨床免疫和科學實驗中應用越來越廣。我國是稀土儲量大國,對TRFIA進行深入研究并推廣應用,對我國生物醫學檢測的發展具有重要意義。
微流控芯片是將傳統生物化學實驗室中進行的實驗操作集成到一張數平方厘米的芯片上,通過芯片結構的設計、多種功能單元的配合,實現試劑的操控、生化反應的進行以及反應結果的檢測。聚二甲基硅氧烷(,PDMS)屬于熱固化型材料,能透過250nm以上的紫外光與可見光,具有加工簡單、可塑性強、成本低廉,以及無色透明、有彈性、透氣性好、有良好的生物兼容性等優點，常被用于制作微流控芯片。微流控芯片由于其消耗樣本少、成本低、操作簡單等優點,也被應用到了毒品檢測當中。Andreou等在微流控芯片的通道中實現了鹽溶液、唾液樣本以及銀納米粒子的穩定層流,可在幾分鐘內檢測出唾液中冰毒的含量。Bailey研究組在玻璃微流控芯片上設計了細長的毛細管通道,實現了微流控芯片毛細管電泳,成功地在芯片上實現了苯丙胺及其類似物的分離檢測。Greenwood等利用化學發光法,在一張玻璃微流控芯片上對阿托品和杜冷丁進行了檢測,檢出限分別可以達到3.8伊10-9mol/L和7.7伊10-8mol/L。上述各方法利用微流控芯片與其它技術結合的方式實現了毒品檢測,但是操作相對復雜,通量較小,因此,需要構建新的高通量微流控芯片方法用于毒品的檢測。
本研究制作了PDMS-多聚賴氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片雜合微流控芯片,將TRFIA技術與微流控芯片技術相結合,采用競爭法的原理,實現了冰毒的時間分辨免疫熒光檢測。每張芯片可同時檢測24個樣本。冰毒抗體偶聯在Eu標記的聚苯乙烯乳膠微球上,在365nm紫外光激發下,標記物可發射610nm紅色熒光,可將冰毒的濃度轉化為熒光強度,通過對熒光圖像進行分析可得到樣本中冰毒濃度。此芯片實現了100~3000ng/mL濃度范圍內冰毒標準品的高通量定量分析,具有較大的檢測范圍和較低的檢出限,能夠對吸食純品冰毒及含冰毒的混合毒品的人員體內冰毒含量進行定量檢測,避免了漏檢情況的發生,對于打擊毒品犯罪、開展禁毒戒毒工作具有重要意義。
2實驗部分
2. 1儀器與試劑
G3P-8旋轉涂覆機；KW-4AH烤膠機；SERIES-60平行紫外曝光機；ARV-310液體混合真空攪拌機；FG-5001空氣等離子體處理機；打孔器；TGL-16G離心機；SHP-150生化培養箱；GelDoc2000型紫外凝膠成像系統；LSP02-18注射泵；濕盒。
四寸單晶硅片；光刻膠SU8-2075、SU8-3025、顯影液；異丙醇、甲苯、無水乙醇；三甲基氯硅烷；聚二甲基硅氧烷；多聚賴氨酸玻片；PBS緩沖液；無RNA酶超純水；牛血清白蛋白、Tween-20；冰毒完全抗原；冰毒標準品、標記冰毒抗體的乳膠微球。
2.2實驗方法
2.2.1模具的制作玻璃-PDMS芯片的制作
芯片的結構如圖1所示,主要由通道層和其下方的PLL玻片組成。
(1) 通道層的制作首先用1mL三甲基氯硅烷滴加在模具表面,靜置10min,以利于脫模;配制25g單體與固化劑比例為10頤1的PDMS,混勻脫氣后倒在模具上,85益加熱40min,得到厚約4mm的PDMS通道層;將PDMS通道層從模具表面揭下,使用直徑1mm的打孔器,在進樣口與出樣口處打孔,切割掉邊緣多余的PDMS,即得到芯片通道層。
(2) 通道層與PLL玻片的封接配制2g單體與固化劑比例為5頤1的PDMS,將其與甲苯按照質量比1頤6混合均勻,將此混合液倒在干凈的硅片上,以1000r/min的速度旋轉20s。將PDMS通道層下表面進行氧等離子體處理,將其置于均勻涂覆了甲苯-PDMS的硅片表面,隨后將沾有甲苯-PDMS混合液的PDMS通道層與PLL玻片貼合,85益加熱24h,即得到芯片。
圖1冰毒檢測微流控芯片:(A)芯片結構示意圖;(B)芯片實物圖。Fig.1Microfluidicchipformethamphetamine(MET)detection:(A)schematicdiagramofMETdetectionchip,and(B)photoofMETdetectionchip.
2.2.3實驗操作步驟
實驗操作步驟如圖2所示,(1)包被MET-BSA將2.5微升200滋g/mLMET-BSA加入反應通道,將芯片放入濕盒中,4益孵育過夜,抽出MET-BSA完全抗原后,用注射泵以5微升/min的速度加入PBST(1伊PBS+0.05%Tween-20),37益放置1h;(2)競爭反應用連接了MET-Ab的2.4滋g/mL乳膠微球溶液將MET-Ag梯度稀釋,取2.5微升通入反應通道,在室溫下競爭反應60min,使用注射泵以5微升/min的速度用15微升PBST清洗反應通道;
(3)成像分析使用紫外凝膠成像儀對芯片的檢測結果進行成像,曝光時間為4s,得到芯片上每條反應通道的熒光圖像,使用ImageJ軟件對每條反應通道的平均灰度值進行數據統計與分析,用軟件OriginPro8.0處理數據,得到檢測結果。
圖2基于時間分辨熒光免疫競爭法檢測冰毒的步驟示意圖Fig.2SchematicdiagramofMETdetectionbasedontime-resolvedcompetitivefluoroimmunoassay
3結果與討論
3. 1PDMS-PLL雜合芯片
芯片主要由兩部分組成:PDMS制作的帶有反應通道和進出口的通道層以及PLL玻片。芯片如圖1B所示,一張芯片上有24條反應通道,能夠同時檢測24個樣本,也可以根據需要選擇合適數量的通道進行檢測。每條通道寬500滋m,高280滋m,長5.5mm,進樣口與出樣口直徑1mm,可通入待測樣本的體積約為2.5微升。24條反應通道之間相互獨立,不存在相互污染與干擾等問題。
3.2芯片材料選擇
PDMS與PLL均具有很好的蛋白質吸附性能。為了選擇更合適的芯片材料,分別制作了以PDMS為通道底面的PDMS-PDMS微流控芯片和以PLL玻片為通道底面的PDMS-PLL雜合微流控芯片,兩種芯片的規格一致。為了比較兩種芯片吸附MET-BSA完全抗原的能力,同時將2.5微升200滋g/mLMET-BSA完全抗原注射進兩張芯片的反應通道中,4益下孵育過夜,隨后加入PBST,37益放置1h,然后用MET抗體濃度為2.4滋g/mL的乳膠微球作為熒光指示劑通入包被了MET-BSA的反應通道中,室溫下進行免疫反應1h,使用PBST沖洗后,在紫外凝膠成像儀中拍攝芯片的熒光圖像。熒光強度越強表示固定在通道表面的完全抗原越多。對比結果如圖3A和3B所示,兩張圖的第一行為陰性對照,用PBS配制1%BSA溶液代替MET-BSA包被通道,未觀察到熒光,表明沒有非特異性吸附,后3行為實驗組,均觀察到熒光,并且圖2B比圖2A熒光強度高。統計圖3A與圖3B中的實驗組熒光強度并繪制熒光強度柱狀圖,得到圖3C。由圖3C可見,PDMS-PLL芯片熒光的灰度值高于PDMS-PDMS芯片約一倍,并且均一性也更好。 造成這一現象的原因是BSA的等電點為4.9,在pH7.4的PBS溶液中BSA帶負電,而PLL玻片帶正電,因此PDMS-PLL芯片對MET-BSA的吸附能力更強,所以PDMS-PLL芯片產生熒光強度更高。PDMS-PLL芯片中PLL玻片是親水的,與全疏水的PDMS-PDMS芯片相比,在包被沖洗過程中更不容易產生氣泡,所以產生熒光的均一性更好。因此選用PLL玻片作為通道底面。
圖3(A)PDMS-PDMS芯片檢測MET-Ab的結果熒光圖;(B)PDMS-PLL芯片檢測MET-Ab的結果熒光圖;(C)PDMS-PDMS芯片和PDMS-PLL芯片中實驗組熒光強度柱狀對比圖Fig.3(A)FluorescentimageofdetectionresultsofMET-AbonPDMS-PDMSmicrofluidicchip;(B)fluorescentimageofdetectionresultsofMET-AbonPDMS-PLLmicrofluidicchip;(C)histogramofintensitiesoffluorescenceofexperimentalgroupsinFig.3AandFig.3B
3.3乳膠微球濃度梯度檢測
本研究采用免疫競爭法,因此偶聯了MET-Ab的乳膠微球的濃度是關鍵因素,其濃度越高,檢測范圍越大。優化了乳膠微球最佳濃度,通道內用過量的200滋g/mLMET-BSA完全抗原包被,乳膠微球從最高濃度2.4滋g/mL用PBST依次稀釋到1.68、1.20、0.72和0.24滋g/mL。從圖4A可見,第一排的陰性對照組沒有熒光,說明沒有非特異性吸附,隨著偶聯MET-Ab的乳膠微球的濃度升高,其它通道熒光強度也逐漸增強,由圖4A可知,熒光強度與抗體濃度成正比,且同一濃度MET抗體的反應通道之間的熒光強度相差不大,這說明設計的PDMS-PLL芯片能夠將MET-BSA均勻地固定在反應通道內壁,且無非特異性吸附。由圖4B可知,熒光強度與抗體濃度有較好的線性關系,說明芯片可將不同濃度的抗體檢測結果很好地反映出來,可用于冰毒檢測。如圖4B所示,當乳膠微球的濃度為2.4滋g/mL時,仍不能占用所有的MET-BSA位點,因此選取最高偶聯MET-Ab的乳膠微球濃度2.4滋g/mL作為競爭反應中的濃度。
圖4(A)PDMS-PLL雜合芯片檢測梯度連接在乳膠微球上的MET-Ab的熒光圖;(B)對應圖(A)的“乳膠微球-灰度值冶曲線Fig.4FluorescenceimageofdetectionofgradientMET-AbconjugatedtolatexmicrospheresonPDMS-PLLchip;(B)curveof“concentrationofMET-Abconjugatedtolatexmicrospheres-theintensityoffluorescence冶correspondingtoFig.4A
3.4冰毒的檢測
將MET-BSA包被在芯片反應通道內表面,樣本中的MET-Ag會與MET-BSA競爭偶聯在熒光乳膠微球上的MET-Ab,因此最終反應通道中的熒光強度越弱,說明樣本中的MET-Ag含量越高。將MET-Ag標準品用2.4滋g/mL乳膠微球稀釋至3000、1000、750、500、200和100ng/mL,各取2.5微升,分別加入反應通道,在室溫下競爭反應1h,隨后使用PBST沖洗反應通道。
使用紫外凝膠成像儀獲取反應后的芯片的熒光圖像。如圖5A所示,1~3為3組重復實驗,每組從上而下的6條通道中MET-Ag的濃度逐漸降低,隨著MET-Ag濃度降低,熒光逐漸增強;第1列的前3行為空白對照,反應通道內未包被MET-BSA;第1列的后3行為陰性對照,競爭反應時MET-Ag濃度為0。隨著MET-*Ag濃度升高,熒光強度減弱。使用ImageJ軟件獲取圖中每條反應通道的熒光強度值,做“MET濃度-熒光強度冶標準曲線,如圖5B所示,隨著樣品中MET-Ag濃度的升高,對應反應通道的熒光強度逐漸降低。當MET-Ag濃度為100~1000ng/mL時,反應通道中的熒光強度迅速下降;而MET-Ag濃度高于3000ng/mL時,熒光強度逐漸趨于平穩。當通道表面修飾的MET-BSA濃度為200滋g/mL,使用乳膠微球濃度為2.4滋g/mL時,PDMS-PLL芯片可在100~3000ng/mL濃度范圍內實現對冰毒的測定。
圖5(A)芯片對冰毒標準品的梯度檢測熒光圖;(B)對應圖(A)的“冰毒標準品濃度-灰度值冶曲線Fig.5(A)FluorescentimageofgradientdetectionresultsofMET-AgonPDMS-PLLchip;(B)curveof“MET-Agconcentrationversusintensityoffluorescence冶correspondingtoFig.5A
4結論
本研究使用PDMS與PLL玻片設計并制作了一種PDMS-PLL雜合微流控芯片,并利用TRFIA原理在芯片上實現了對冰毒的高通量檢測。此芯片僅利用PDMS與PLL材料自身的特性即可實現MET-Ag的均勻包被,無需使用其它試劑反復修飾反應通道,制作簡單,成本低廉。每個反應通道體積僅為2.5微升,所需樣本量小。每張芯片能夠在70~80min內同時檢測24個獨立的冰毒樣本,檢測通量高,且僅需一次紫外熒光成像即可得到全部24個樣本的檢測結果,可實現100~3000ng/mL濃度范圍內冰毒的定量檢測,檢測靈敏度高,動態范圍大,有望應用于現場即時毒品檢測。
（文章來源:分析化學DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.181216作者：孫敬敬宋祺牟穎轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）