多種單細胞共培養可以模擬與生物體內相似的微環境。但傳統方法耗費大量的試劑及資源，且不便于實時觀察及后續檢測。微流控技術為細胞體外培養注入新的活力。采用微流 控技術采微細加工工藝制作的細胞培養載體可 以在很大程度上克服傳統方式的不足。通過加工通道特征尺寸在 10–100 μm 的細胞培養微芯片可以極大地限制培養細胞的數量，彌補傳統 細胞培養和動物實驗不能動態操控和實時觀察的不足；而且由于其有效的熱質傳輸效率，能夠更加有效地反映體內環境。

通過加工具有特定功能的芯片三維空間結構，可以有效控制細胞的空間位置。Zhou等研究了肝細胞及星狀細胞的共培養及其對酒精刺激的作用，Harper 等探究了癌細胞與免疫細胞的 實時作用。

據報道，腫瘤的發生和轉移與腫瘤細胞所 處的內外環境有著密切關系。它不僅包括腫瘤所在組織的結構、功能和代謝，而且亦與腫瘤細胞自身的內在環境有關。腫瘤血管生成是腫瘤細胞生存的基礎，而腫瘤血管形成依賴于內 皮細胞的生長。同時與腫瘤相關的成纖維細胞 也是腫瘤微環境中的關鍵細胞。本文設計和制 作具有“微壩”和“微縫”結構的細胞共培養 微流控芯片，具有細胞圖形化的特點和功能， 有效地解決細胞共培養中無序混合、摻雜生長 等問題。本研究選擇人肺腺癌細胞、人胚肺成 纖維細胞和人內皮細胞進行共培養，實現細胞 在特定空間生長繁殖，能夠滿足實時觀測的需求， 為進一步研究肺癌微環境提供有效的技術平臺。

1 方法

1.1 微通道內流體力學分析

在流體力學中，流體流態一般用雷諾數(Re) 表示：

Re=ud/v

其中，u為對應流體的速度，d為流體管道內徑，v為對應流體的運動粘度(v=μ/ρ，ρ為對應流體的密度，μ為流體的動力粘度)；雷諾數是量綱為1的量，其數值的大小可反映單相流體的流態，當Re < 2 000，流體呈層流狀態，在芯片內部，微通道是微米級別，其流體雷諾數一般小于1，故其內部流體仍屬于層流狀態，如圖 1所示，其內部主流部分用紅色箭頭示意，即主流與通道結構保持一致，有部分流體流經“微壩”下的“微縫”區域，這也是“C型微壩”可截留目標細胞的流體力學基礎。

圖1 芯片內部微通道流體流向三維示意圖

1.2 細胞共培養微結構的設計及芯片工作原理

本設計中，要求微流控芯片能夠有效在特 定位點“截留”細胞。通過在對應區域設計“微 壩”結構攔截不同種類細胞而不互相混雜，從而實現不同細胞間的物理隔離。通過不足 10 μm 的微縫隙攔截到直徑大于 10 μm 的細胞個體。 細胞尺寸量級在 10–100 μm，與光刻膠厚度量級契合，在尺度上可與微流控芯片良好結合， 可通過控制涂膠厚度實現不同大小的細胞的實驗研究需求。圖 2 為微流控芯片單元設計示意 圖，圖 A 為微通道剖面圖，示意含有細胞的培 養液流經聚二甲基硅氧烷(PDMS) 與玻璃基底 之間的通道，可較好地被微通道內部突起的 C 型 攔截壩截留；微縫寬度不到 10 μm，可攔截細胞； 圖 B 表明細胞能夠停留在目標區域，即 C 型攔截 壩。由于微縫的作用，培養基中小分子營養物質 可以自由流通，實現各個區域細胞的獨立培養。

圖 2 芯片結構示意圖

2 微流控芯片

2.1 微流控芯片的制作方法

采用 piranha 清洗方法 (濃硫酸和過氧化 氫比例為 7∶3) 對硅片表面進行清潔處理。根據設計要求將涂覆有 SU8光刻膠的硅片置于甩膠機上，分預甩和甩膠兩步，在其表面旋涂致密均勻的既定厚度的膠膜；采用熱板加熱的方 式來對硅片進行前烘處理，前烘是為了去除膠體中適量溶劑，增強光刻膠的粘黏性。采用 直接接觸式曝光，根據膠膜厚度不同選擇相應 的曝光時間，確保掩膜板的光面與硅基襯底緊 密貼合，這一過程可將掩膜板上的圖形轉移到 硅片上。后烘可促進光刻膠內部化學反應的進 行，從而使其部分區域交聯；將后烘過的硅 片放置于盛有丙二醇甲醚醋酸酯溶液 (PGMEA) 中進行顯影反應，可將硅片放入異丙醇溶液中， 如果沒有出現白膜則說明反應已完全。然后用去離子水洗凈，N2 吹干。為了降低硅基模具表面親和性，便于后續工藝脫模，將硅片放置在含有少量氟硅烷溶液的真空干燥器中，于 通風櫥中抽真空后，靜置過夜后得到芯片模具。 其制備工藝流程如圖 3 所示。將 PDMS 與固化劑按 10∶1 (重量比) 混合均勻，于真空干燥器 抽真空至氣泡完全消失，在水平臺面上澆注 PDMS，置于熱板 85 ℃烘焙 30 min，自然冷卻 至室溫，小心從襯底上剝離，打孔切片后備用。 將制備好的 PDMS 芯片與 1 mm 載玻片表面進行等離子處理，然后鍵合得到微流控芯片。

圖 3 微流控芯片制備工藝

2.2 微流控芯片相關表征

芯片內部通道的連通性，使用紅色染料灌注測試，如圖 4A 所示，微通道內部高低錯落， 結構分明，圖 4B 中可以看出，通道內部的深紅 色表明主流流經區域，而通道之間的淺紅色部分 表明各通道相應區域本質“連通”。連通的液體 可為物理隔離的各種細胞提供生長所需的營養 物質，維持其生命活動。其中細胞培養單元中細 胞攔截區域即“C 型壩”半徑為 90 μm，“壩高” 約為 42 μm，微通道寬度為 80 μm，高約 50 μm。

圖4 細胞芯片圖像 (A：實物圖；B：單元光學圖； C 和 D：SEM 圖像)

3 基于微流控平臺的細胞共培養

3.1 前處理

對于微流控芯片，其前處理主要目的是在芯片內部營造適宜細胞生長、繁殖的微環境，步驟主要包括：滅菌及孵育。將芯片在75%乙醇溶液中浸泡1 h，抽真空處理，置于紫外燈下光照滅菌。使用注射泵以一定流速向芯片內部通道注入完全培養基，于CO2培養箱孵育過夜。

3.2 細胞導入和培養

本實驗采用人胚肺成纖維細胞(HFL1，中國科學院上海細胞庫)、人肺腺癌細胞(A549，中國科學院上海細胞庫)、人臍靜脈內皮細胞(HUVECs，ATCC) 三種細胞共培養，共培養培養基采用DMEM細胞培養基(10%胎牛血清、0.1%鏈青雙抗)，培養溫度設定37.0 ℃，CO2濃度為5%。

將培養皿中已貼壁細胞進行消化，離心后重懸，得到適宜濃度的細胞重懸液(濃度約1×106cells/mL)；采用注射泵正壓注入的方法向經前處理的芯片中導入細胞，由于細胞懸液長時間放置很容易產生細胞聚沉，造成細胞進樣的不穩定及不連續性。通過多次進行實驗探究，將導入過程控制在10 min以內較有利于實驗進行；同時通過對實驗過程中芯片內部各區域的觀察，也確定了細胞懸液進樣速率與區域分布的關系，如表 1所示。將進樣速率控制在0.3-0.8 mL/h既能夠使細胞充分填布相應攔截區域，又不至于通道內部流速過大將其“沖走”。圖 5A中流速0.2 mL/h，為過填充，圖 5B流速0.5 mL/h，為理想填充，圖 5C流速1.2 mL/h，表明細胞溢出相應區域。

表1 細胞懸液進樣流速控制

圖5 不同流速控制下細胞進樣圖像

4 結果與分析

基于微流控平臺的芯片制備，結合本實驗室相關制備條件參數，經過清洗、烘干、涂膠、 甩膠、前烘、曝光、后烘、顯影和堅膜等一系列工藝步驟之后，得到硅基芯片模具。通過在模具上澆注 PDMS，熱烘固化后使用等離子清洗機對 PDMS和玻璃載玻片進行表面處理后即為不可逆鍵合，最終得到一批較為良好的微流控細胞共培養芯片。對所得微流控芯片進行相應生物學處理，主要目的在于滅菌，使其內部通道微環境適于細胞生長增殖。在細胞懸液灌 注過程中，可明顯看到微通道內部分細胞依次停留在“微壩”區域，且排列緊湊 (圖 6)，具 有細胞構圖的功能。在導入細胞懸液后，經過 一定時間 (不同細胞貼壁時間有所差異)，細胞貼壁生長。細胞貼壁后，其形態發生變化，表現出增殖、遷移等行為。將 HUVECs、HFL-1 及 A549 共培養于微流控芯片中，細胞生長狀況 良好 (圖 7，8)。

圖6 細胞導入過程圖

圖 7 三種細胞在芯片腔體內共培養 (24 h)

圖8 在芯片腔體內各細胞形態圖 (24 h)

本文基于微流控制作平臺，通過軟光刻技術，制備一批用于細胞共培養的微流控芯片。Chung等通過在微芯片內部放置凝膠物質，探究了共培養環境下細胞向凝膠內部遷移行為。Patel等通過設計灌注有聚乙二醇的中間通道驗證兩側微腔室內相關癌細胞旁分泌相互作用。本文中具有“微壩”結構連通區域的芯片可起到在特定區域攔截細胞的作用；通過設計“微壩”及“微縫”位置及結構，實現無內置凝膠狀態下，同一空間特定位置培養特定細胞層，有效避免細胞共培養中無序混合，摻雜生長等問題。在此基礎上，我們將進一步探究各種類細胞間相互作用，連續、動態、實時觀察其相互作用后的形態學變化。本研究為共培養過程中細胞遷移及相互作用、腫瘤微環境模擬提供一種新的有效實驗思路，而且也可為后續開展藥物篩選、新藥研發提供支持。

文獻鏈接：

王帥超, 葛玉卿, 吳蕾,等. 三種細胞共培養微流控芯片的設計和制作. 生物工程學報, 2017, 33(2): 294-300

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