微流控技術(shù)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用
生命科學(xué)中持續(xù)的研究熱點(diǎn)之一是修飾(或者重編程)細(xì)胞基因組進(jìn)而影響特定蛋白質(zhì)的合成、沉默某些基因、獲得選擇的細(xì)胞特性，其具體研究中必備的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)是將外源核酸導(dǎo)入源核酸在物理化學(xué)性、代謝性方面克服質(zhì)膜與/或核膜等胞內(nèi)障礙，抵達(dá)并無(wú)損地整合到細(xì)胞中。其中，病毒介導(dǎo)的生物學(xué)途徑盡管有很高效率，但因?yàn)槊庖咝耘c毒性方面的安全問(wèn)題，采用這種轉(zhuǎn)染技術(shù)越來(lái)越謹(jǐn)慎。
近十年來(lái)，眾多文獻(xiàn)持續(xù)探討、綜述細(xì)胞轉(zhuǎn)染的機(jī)制以及已有各種轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)劣。在轉(zhuǎn)染機(jī)制的基礎(chǔ)研究方面，從細(xì)胞膜胞吞過(guò)程到細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)與載體之間的釋放機(jī)制與代謝途徑再到核質(zhì)傳輸過(guò)程，關(guān)注點(diǎn)是外源遺傳物質(zhì)在載體介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn)，為比較不同轉(zhuǎn)染技術(shù)效率提供理解基礎(chǔ)。顯然，不同技術(shù)背后所涉及的轉(zhuǎn)染過(guò)程很不相同，許多文獻(xiàn)綜述了特定技術(shù)途徑的發(fā)展現(xiàn)狀或其中的一些側(cè)面。例如，Escoffre等針對(duì)質(zhì)粒DNA在許多活體組織類(lèi)型中的轉(zhuǎn)染方法的應(yīng)用及如何克服轉(zhuǎn)染障礙的現(xiàn)狀作了綜述。Rao等對(duì)脂介導(dǎo)途徑所涉及的細(xì)胞過(guò)程作了十分詳細(xì)的綜述與評(píng)論。化學(xué)途徑中，納米粒子以及結(jié)合脂復(fù)合體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法發(fā)展迅速。物理途徑方面，Sophie等、Villemejane等先后作出較為全面的綜述；其中不同的具體技術(shù)，如電穿孔、聲穿孔、光穿孔等也有作者作出專(zhuān)門(mén)綜述。這方面，尤其令人注意的，電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)是一個(gè)熱點(diǎn)，先后有Golzio等、Favard等、Zaharoff等、Escoffre等、Fox等、Wang等從不同側(cè)面不同角度作出精彩評(píng)述或綜述。
在閱讀這些文獻(xiàn)過(guò)程中，我們注意到在細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)領(lǐng)域，朝著改進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、提高安全性方向，近年來(lái)有逐漸向微型化技術(shù)途徑方面發(fā)展的趨勢(shì)。例如，轉(zhuǎn)染試劑納米化，在納米粒子輔助下以層層涂覆方式改善轉(zhuǎn)染，提出所謂納米級(jí)的基因載體(Nanovectors)；以微陣列方式點(diǎn)印核酸片段的表面上以常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑孵育細(xì)胞，構(gòu)成轉(zhuǎn)染微陣列；尤其是，離體培養(yǎng)細(xì)胞的電穿孔技術(shù)出現(xiàn)了許多與微流控技術(shù)相結(jié)合的形式等。這些新發(fā)展，給我們從微尺度角度審視細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)程的新機(jī)會(huì)。一般地看，任何的轉(zhuǎn)染流程，在外源核酸分子或其與載體的復(fù)合物在進(jìn)入胞內(nèi)之前，必須實(shí)現(xiàn)2個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，一是要使核酸盡可能接觸到膜，二是要誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生可逆變化，如使膜上能夠瞬間開(kāi)孔(達(dá)成瞬間通透)，使外源核酸分子在該通透處進(jìn)入到膜內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)中。許多物理途徑如微注射等方法均是實(shí)現(xiàn)上述步驟而發(fā)展出的技術(shù)形式。因?yàn)榧?xì)胞尺度、核酸及其載體尺度的限定，介質(zhì)的流動(dòng)特性，使得以研究微尺度上的流動(dòng)行為、流動(dòng)控制或操縱為對(duì)象的新興微流控學(xué)正在成為實(shí)現(xiàn)上述過(guò)程的技術(shù)新角度。本文試圖對(duì)近年來(lái)涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的微流控技術(shù)作出綜述，以期對(duì)此領(lǐng)域有一個(gè)全面的了解。
1微陣列方式的轉(zhuǎn)染技術(shù)
微陣列技術(shù)一般是在固態(tài)表面上以陣列化方式間隔排布相互作用體系中的一方，而另一方則以流動(dòng)方式與陣列化的一方接觸，實(shí)現(xiàn)其中相互作用的完成。2001年Ziauddin和Sabatini[28]首次將這種技術(shù)方式應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。其做法是，將(相同或不同)質(zhì)粒DNA片段混溶在明膠溶液中，采用在DNA微陣列技術(shù)中發(fā)展的納升級(jí)點(diǎn)樣儀，在載玻片上點(diǎn)樣形成微陣列，待干化后，將這些質(zhì)粒DNA微點(diǎn)陣列浸浴于脂轉(zhuǎn)染試劑中，片刻后吸走脂轉(zhuǎn)染試液，并在這些微陣列上孵育動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中攝入其底部明膠微點(diǎn)中的質(zhì)粒DNA，分裂2~3次后在載玻片上形成由轉(zhuǎn)染細(xì)胞簇所組成的轉(zhuǎn)染細(xì)胞微陣列(Transfectedcellmicroarrays)，陣列微點(diǎn)的直徑約100~120?m(相互間隔300~400?m)，其中包含的轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)通常為30~80個(gè)。因?yàn)檫@種方式與常規(guī)的轉(zhuǎn)染做法在細(xì)胞與DNA加樣順序上相反，這些作者也將這種轉(zhuǎn)染技術(shù)稱(chēng)為逆向轉(zhuǎn)染(Reversetransfection)。其中也可以將脂轉(zhuǎn)染試劑點(diǎn)樣操作之前加入在質(zhì)粒DNA的明膠溶液中。此方法的優(yōu)點(diǎn)是，由于轉(zhuǎn)染細(xì)胞簇之間間隔不到400?m，其陣列化排布的細(xì)胞簇密度是384孔板的200倍，大大地增加了轉(zhuǎn)染及后續(xù)分析通量，而且這種縮微對(duì)質(zhì)粒用量需求大為減少，被固化在明膠中的cDNA還可穩(wěn)定保存4個(gè)月。
近來(lái)，通過(guò)這種逆向轉(zhuǎn)染陣列方式構(gòu)建出RNAi微陣列，被應(yīng)用來(lái)系統(tǒng)地制備敲除基因的細(xì)胞，并進(jìn)行喪失某些細(xì)胞功能的高通量篩選[31]，德國(guó)Sturzl等[32]對(duì)這一技術(shù)作了較為全面的綜述。
2縮微流動(dòng)空間中的轉(zhuǎn)染
2.1簡(jiǎn)單微通道
直微通道是微流控技術(shù)中最基本的構(gòu)件，但即使是這樣簡(jiǎn)單的微尺度空間，也可以為細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供可行的微環(huán)境。Li等[33]利用簡(jiǎn)單微通道構(gòu)成的微空間來(lái)實(shí)施細(xì)胞的脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。PDMS通過(guò)與玻璃鍵和形成微管道，其長(zhǎng)/寬/高分別為1cm/900μm/60μm。他們討論了在這樣一種簡(jiǎn)易的微芯片裝置上利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP-N2導(dǎo)入COS-7細(xì)胞的過(guò)程，并探討了最適宜的脂質(zhì)體濃度等問(wèn)題。他們所用的裝置很簡(jiǎn)單，構(gòu)成的芯片可以創(chuàng)造微環(huán)境來(lái)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染，其中在將細(xì)胞種植在微通道之前需要先用0.01％(W/V)Poly-L-Lysine(PLL，Sigma，USA)孵育通道以促進(jìn)細(xì)胞的粘附。
轉(zhuǎn)染效率可以通過(guò)綠色熒光蛋白的表達(dá)確定。脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率與陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的比率、陽(yáng)離子脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)體顆粒的大小等有關(guān)。他們得出轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨著脂質(zhì)體濃度的增大而提高，當(dāng)含脂質(zhì)體為1μL的時(shí)候?yàn)镃OS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染的最適條件即高的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率，當(dāng)達(dá)到2μL的時(shí)候，微通道中細(xì)胞數(shù)量會(huì)急劇減少也就是細(xì)胞存活率很低但轉(zhuǎn)染效率卻很高。不過(guò)最適的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率會(huì)隨質(zhì)粒DNA的純度和脂質(zhì)體的濃度而變化，另外質(zhì)粒必須是無(wú)內(nèi)毒素的，否則也會(huì)有很大的負(fù)面作用。這種陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法不需要太多的設(shè)備、特殊的芯片或是電極等，在一般實(shí)驗(yàn)室可以方便地進(jìn)行試驗(yàn)。
2.2直微通道與微孔陣列的簡(jiǎn)單結(jié)合
Nagamine等[34]實(shí)現(xiàn)了用微流控芯片對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如圖1所示。所用的裝置由PDMS通道和一個(gè)硅襯底組成，PDMS微通道的長(zhǎng)寬高分別為5.0mm/500μm/25μm，硅底片上有兩排錐形孔，微孔的大開(kāi)口為400×400μm2，小開(kāi)口為100×100μm2。兩者鍵合后，首先將質(zhì)粒DNA溶液通過(guò)微通道口加入并干燥于硅片上的錐形孔中，再將感受態(tài)細(xì)胞注入微通道中，從而使感受態(tài)細(xì)胞暴露于質(zhì)粒面前，之后經(jīng)過(guò)熱休克促進(jìn)轉(zhuǎn)化后把上面的PDMS微通道剝離，硅底片在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以下的工作包括質(zhì)粒表達(dá)的鑒定和轉(zhuǎn)化效率等同傳統(tǒng)方法差不多，研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率也不同，可能緣于質(zhì)粒DNA長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的不同。
圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)程
3微流控液滴技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染
目前文獻(xiàn)可見(jiàn)有兩種利用液滴來(lái)實(shí)施細(xì)胞轉(zhuǎn)染。一是操縱液滴使其溶解混入基因片段，并投送給目標(biāo)細(xì)胞；二是操縱液滴包封細(xì)胞，利用電穿孔方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
Wu等[35]利用微流控生成的微液滴作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體。他們首先制作了一個(gè)大小可調(diào)且產(chǎn)生的液滴均一(尺寸差別＜7.1％)的微流控芯片，在一個(gè)T型交叉微通道靠近交叉點(diǎn)的上方添加一個(gè)充有壓縮空氣的薄膜腔，通過(guò)空氣壓縮薄膜對(duì)液滴大小進(jìn)行調(diào)節(jié)。在相同的連續(xù)相和分散相的流速比率下，施加在薄膜上的壓力越大產(chǎn)生的液滴越小，產(chǎn)生液滴的頻率越快，薄膜的調(diào)節(jié)由一個(gè)電磁閥開(kāi)關(guān)和一個(gè)壓縮機(jī)控制。
完成了第一步即按需產(chǎn)生大小均一的液滴后，就為下一步的利用液滴轉(zhuǎn)染打下了基礎(chǔ)。液滴可以被用作載體將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入到COS-7細(xì)胞中，將脂質(zhì)的藥物依賴(lài)性抗體溶于鯊烯油中來(lái)產(chǎn)生液滴而表面帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA可以結(jié)合在這些液滴的表面從而使液滴成為了載體。液滴由于重力作用會(huì)下沉到連接的培養(yǎng)皿底部進(jìn)而增加了與細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)。當(dāng)給COS-7細(xì)胞裂解物加入熒光素和ATP后，基因的轉(zhuǎn)染就可以通過(guò)發(fā)射光來(lái)表征。研究表明，液滴越小轉(zhuǎn)染效率越高，這源于液滴越小表面積對(duì)體積比值越大，能夠攜帶更多的DNA。但該工作有待完善的地方在于在實(shí)施細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，該工作還沒(méi)有將形成DNA液滴與轉(zhuǎn)染過(guò)程實(shí)現(xiàn)集成。
Xiao等[36]同樣利用T型結(jié)構(gòu)的微流控裝置進(jìn)行了液滴轉(zhuǎn)染，不過(guò)利用液滴的方法不同，他們是將細(xì)胞包到微液滴(直徑50μm左右)中后再進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，這可以有效避免傳統(tǒng)電穿孔的復(fù)雜過(guò)程，并能精確操縱細(xì)胞。另外其優(yōu)勢(shì)還在于：控制包埋細(xì)胞的液滴比水溶液中的單個(gè)細(xì)胞更容易和精確，能將電極處的電化學(xué)反應(yīng)降低到最低。Zhan等[37]亦在基于液滴的微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了電穿孔轉(zhuǎn)染。這兩種方式的轉(zhuǎn)染都是將液滴作為了一個(gè)運(yùn)輸載體，并達(dá)到了轉(zhuǎn)染的目的。
4微流控注射技術(shù)
毛細(xì)管微注射(Capillarymicroinjection)——其轉(zhuǎn)染是在顯微鏡下通過(guò)精密微操縱器將微注射針直接插入細(xì)胞的方式來(lái)實(shí)施的。
按照轉(zhuǎn)染試劑流控傳輸機(jī)制的不同，有兩種毛細(xì)管微注射方式，一種是利用毛細(xì)管壓差驅(qū)動(dòng)(Capillarypressuremicroinjection，CPM)，另一種是基于動(dòng)電原理的離子電泳(Ionophoresis)。毛細(xì)管微注射技術(shù)可以達(dá)到很高的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞毒性也很低[38]。其中前一種方式，實(shí)現(xiàn)技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，也很直接[8]，但是，毛細(xì)管壓差驅(qū)動(dòng)方式的不足在于向細(xì)胞傳輸?shù)脑噭w積變動(dòng)很大(甚至達(dá)5倍以上)，因此轉(zhuǎn)染結(jié)果可重復(fù)性差[39]，另外，注射量以及施加壓力對(duì)于注射針直徑大小有約束，現(xiàn)有商業(yè)化的微注射系統(tǒng)中，大多施加500kPa的壓力，相應(yīng)的微針尖端直徑被限制在200~500μm，顯然這一尺寸對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞而言仍舊顯得太大。為了采用直徑更小的微針，有必要采用離子電泳方式來(lái)驅(qū)動(dòng)試劑向細(xì)胞的傳輸。離子電泳是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，將一對(duì)微電極分別插入注射微針與細(xì)胞介質(zhì)中，兩電極施加電壓后誘導(dǎo)試劑電泳，顯然這就克服微注射對(duì)針尖直徑的限制[40]，但是這種轉(zhuǎn)染過(guò)程速度很慢，并依賴(lài)于所注射的試劑離子性質(zhì)，而且傳輸試劑的定量化仍舊存在問(wèn)題[41]。無(wú)論哪種方式，轉(zhuǎn)染的通量與操作技術(shù)的復(fù)雜度也約束著這類(lèi)技術(shù)的實(shí)用性。
圖2微流控芯片中的單細(xì)胞微注射系統(tǒng)
現(xiàn)在微流控技術(shù)有可能克服這一技術(shù)方式中存在著的上述諸多問(wèn)題[42]。在微流控芯片上，可以把細(xì)胞微注射操作的前后過(guò)程如細(xì)胞培養(yǎng)、分類(lèi)、可行性測(cè)試等集合在一起完成。如圖2a中實(shí)現(xiàn)了在微流控操縱下將細(xì)胞引導(dǎo)到接近固定的微注射針尖處，此時(shí)閥1打開(kāi)閥2關(guān)閉；圖2b中細(xì)胞觸及微針尖，細(xì)胞膜被刺破形成穿孔，微注射即得以實(shí)現(xiàn)；圖2c中閥2打開(kāi)閥1關(guān)閉時(shí)流體便會(huì)帶動(dòng)細(xì)胞從通道B流到細(xì)胞收集器中。這樣的微流控操縱過(guò)程不僅實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)微注射[29]，也能減小由于細(xì)胞環(huán)境的改變而帶來(lái)的潛在危害。
5微流控電穿孔技術(shù)
電穿孔是指通過(guò)電場(chǎng)施加電脈沖后，在細(xì)胞膜表面會(huì)產(chǎn)生多個(gè)短暫細(xì)孔，分子可以被轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)出細(xì)胞，電穿孔轉(zhuǎn)染便是將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染的微流控芯片各式各樣卻也大同小異，其基本上分為兩類(lèi)：針對(duì)多細(xì)胞的和針對(duì)單細(xì)胞的電穿孔芯片。
5.1微流控芯片中的多細(xì)胞電穿孔
這類(lèi)芯片轉(zhuǎn)染以Lin[14]設(shè)計(jì)的4種電穿孔微芯片最具有代表性和普遍性。Lin[14]利用MEMS技術(shù)設(shè)計(jì)制作了4種電穿孔微芯片來(lái)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。第1種是有微通道和平板電極的流動(dòng)式電穿孔芯片(圖3a)，用于將質(zhì)粒導(dǎo)入懸浮細(xì)胞中，質(zhì)粒和細(xì)胞流入微通道中后用短暫電脈沖進(jìn)行電穿孔；第2種是雙電極電穿孔芯片(圖3b)，主要用于粘附細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染；第3種是用成角度的叉指電極對(duì)雙電極電穿孔芯片的改進(jìn)版(圖3c)，主要可以降低電壓和提高場(chǎng)強(qiáng)；第4種是整合了DNA預(yù)富集功能的叉指電極電穿孔芯片(圖3d)，是利用電泳吸引力可以增加細(xì)胞表面質(zhì)粒DNA的濃度并提高轉(zhuǎn)染效率。這4種芯片各有自己的特點(diǎn)，當(dāng)然第4種的效果好些，不僅細(xì)胞和質(zhì)粒的需要量少，電穿孔電壓低，并且細(xì)胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備過(guò)程也較簡(jiǎn)單，還可以得到聚集的DNA。Lin通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出了第4種芯片的最適參數(shù)，即電極間距50μm、質(zhì)粒濃度80μg/mL、脈沖電壓6V、脈沖2Hz。在此條件下，將質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入BCC(基底細(xì)胞癌的細(xì)胞株)的平均轉(zhuǎn)染效率達(dá)到35.89％。
芯片上的電穿孔需要利用電壓擊穿細(xì)胞膜，所以就要有不同的電壓產(chǎn)生電場(chǎng)來(lái)滿(mǎn)足實(shí)際需要。為此，Kim等[13]設(shè)計(jì)了一種多通道電穿孔微芯片，在這個(gè)芯片中有5個(gè)不同長(zhǎng)度的微通道，所以能夠在一個(gè)芯片中在相同電壓下同時(shí)產(chǎn)生5種不同梯度的場(chǎng)強(qiáng)，也就相應(yīng)的有5種不同的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。這對(duì)于探索基因轉(zhuǎn)染的最佳條件更加方便和快速。
在將綠色熒光蛋白質(zhì)粒分別導(dǎo)入HEK-293細(xì)胞和CHO細(xì)胞后得到了各自最高表達(dá)的場(chǎng)強(qiáng)條件，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率都比較高時(shí)的條件便是最佳條件，在最佳條件下轉(zhuǎn)染效率能超過(guò)80％并保證細(xì)胞存活率在70％以上。雖然高的電場(chǎng)強(qiáng)度更有利于基因進(jìn)入細(xì)胞但卻會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，使整體轉(zhuǎn)染效率降低。所以在這種多通道芯片中就能方便找到高轉(zhuǎn)染效率和高細(xì)胞存活率的并存的條件。另外，施加越高的電場(chǎng)，脈沖持續(xù)時(shí)間應(yīng)該越短或者相同時(shí)間內(nèi)連續(xù)的脈沖相比單一的脈沖更能得到高轉(zhuǎn)染效率和高細(xì)胞存活率。脈沖的波形也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響。
一般電穿孔試驗(yàn)中在金屬電極附近會(huì)產(chǎn)生氣泡、化學(xué)污染或是由于電極產(chǎn)生局部高溫造成細(xì)胞熱休克，這些對(duì)轉(zhuǎn)染都會(huì)有不良影響作用，為了解決這個(gè)問(wèn)題，Kim等[12]利用聚二烯二甲基氯化銨溶液中(pDADMAC)離子的導(dǎo)電性來(lái)構(gòu)建鹽橋而避免了氣泡的產(chǎn)生。pDADMAC用來(lái)對(duì)微通道中細(xì)胞提供電勢(shì)差。pDADMAC的導(dǎo)電率約為16S/m，當(dāng)輸入電壓為10V時(shí)可以產(chǎn)生0.9kV/cm的電場(chǎng)，這滿(mǎn)足電穿孔所需要的條件。利用此微流控裝置對(duì)人體的K562白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，輸入電壓15V，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到60％并且細(xì)胞存活率為80％，而在恒定的電勢(shì)差下每分鐘可以轉(zhuǎn)染約105個(gè)細(xì)胞，即也可以進(jìn)行高通量的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
此外，Zhan等[37]提出了一種利用液滴進(jìn)行電穿孔的方法，將細(xì)胞液滴形成在油相中，包含細(xì)胞的液滴隨油相流動(dòng)到固定在下游通道某處的微電極表面，電極施加電壓時(shí)，可跨液滴使其內(nèi)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)電穿孔。電穿孔的間隔時(shí)間和強(qiáng)度可根據(jù)液滴的尺寸(長(zhǎng)約60~386μm)和流速(1.38~8.86m/min)決定，兩電極間距約20μm，施加電壓大小5~9V。
圖3四種電穿孔芯片
使用此裝置，他們將含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒成功地導(dǎo)入到CHO細(xì)胞中表達(dá)。雖然實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率會(huì)隨著電壓的升高而降低，但是，利用操縱微液滴這種確定的微小空間實(shí)現(xiàn)將外源基因?qū)爰?xì)胞的靈活便利是顯而易見(jiàn)的。
Geng等[10]設(shè)計(jì)了一種流動(dòng)式的電穿孔芯片，在恒定電壓下通過(guò)流動(dòng)進(jìn)行大量的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，其中流速為20mL/min，轉(zhuǎn)染效率依然可以達(dá)到75％。同時(shí)設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的特點(diǎn)也便于平普通實(shí)驗(yàn)室的使用。Huang等[16]同樣利用流動(dòng)式的電穿孔芯片達(dá)到高效轉(zhuǎn)染和操縱細(xì)胞的目的，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，加載的細(xì)胞通過(guò)微流控通道可以逐個(gè)地被電通透到轉(zhuǎn)染點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的100％的操控率，也就可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Wang等[11]制作了一種蛇形半連續(xù)流動(dòng)的芯片，在這種芯片里由于氣泡和焦耳熱產(chǎn)生的少，避免了細(xì)胞裂解產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片，使細(xì)胞的存活率超過(guò)50％，基因表達(dá)效率約為10％~15％。
芯片上進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢(shì)在于PDMS的可透性給我們提供了可以看到轉(zhuǎn)染過(guò)程的機(jī)會(huì)。在電穿孔芯片上通過(guò)可視圖化研究，有利于更好理解電轉(zhuǎn)染的機(jī)制，提高我們對(duì)通道中細(xì)胞的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能力[15]。
5.2微流控芯片中的單細(xì)胞電穿孔
不同于多細(xì)胞電穿孔中的大量轉(zhuǎn)染，單細(xì)胞電穿孔中電場(chǎng)是施加于單個(gè)細(xì)胞的，許多大量轉(zhuǎn)染無(wú)法解決的問(wèn)題可以由單細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)染來(lái)完成。Wang等[24]就曾針對(duì)這一方面進(jìn)行過(guò)綜述。單細(xì)胞電穿孔可以用于基因和蛋白表達(dá)的高通量篩選，對(duì)于藥物發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制以及干細(xì)胞的研究都有重要意義。
人體THP-1(單核白血球)細(xì)胞在白血病的研究中有重要作用，但常規(guī)的轉(zhuǎn)染進(jìn)行基因修復(fù)卻很難得到，并且進(jìn)行大量的電穿孔轉(zhuǎn)染時(shí)絕大數(shù)這種細(xì)胞不能表達(dá)外來(lái)基因，細(xì)胞的存活率也相當(dāng)?shù)汀itert等[44]設(shè)計(jì)了一種單細(xì)胞電穿孔微流控芯片來(lái)解決了這個(gè)問(wèn)題，且提高了轉(zhuǎn)染效率。該芯片由兩條微通道組成，通道中間由9個(gè)細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)連接。通道的一側(cè)為平板電極，另一側(cè)對(duì)應(yīng)的是9個(gè)寬度與細(xì)胞直徑相當(dāng)?shù)碾姌O。當(dāng)細(xì)胞樣從進(jìn)樣口加入后，在兩電極之間被捕獲，而此種結(jié)構(gòu)可以一次性對(duì)9個(gè)單細(xì)胞同時(shí)電穿孔，因此有利于進(jìn)行高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率也相應(yīng)提高。
此外，Cho等[45]提出了一種3D的單細(xì)胞電穿孔芯片，該芯片是由一條通道和用于產(chǎn)生電場(chǎng)的懸臂式微電極對(duì)組成，其中微通道的尺寸是：長(zhǎng)4mm、寬10~40μm、深20μm，雙懸臂梁之間的間距是10~20μm，與靶細(xì)胞的尺寸相當(dāng)。這種電極裝置的特點(diǎn)是可以將低電壓放大并可在兩電極之間捕獲單個(gè)細(xì)胞，因此樣本細(xì)胞從入口處經(jīng)由微通道到達(dá)兩電極之間時(shí)，細(xì)胞膜便在此處被放大的電壓擊穿形成穿孔。這樣細(xì)胞在電穿孔過(guò)程中受到的損傷很小，轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率也就相應(yīng)增高。這種芯片的特點(diǎn)是：所需電壓更低；有不均勻的電場(chǎng)；電極與細(xì)胞間的間距更小。當(dāng)在兩個(gè)電極之間施加0.7V的電壓時(shí)在尖端的最大場(chǎng)強(qiáng)可以達(dá)到3×104V/m。當(dāng)流動(dòng)的細(xì)胞連續(xù)加入該電穿孔芯片時(shí)可以進(jìn)行高通量的電穿孔轉(zhuǎn)染。
而當(dāng)前，干細(xì)胞的研究是一個(gè)熱點(diǎn)，即把人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的基因修復(fù)用于自身修復(fù)或他人移植，而將干細(xì)胞與微流控芯片結(jié)合起來(lái)探討，也是現(xiàn)在研究中的一個(gè)趨勢(shì)。Valero等[46]就在微流控裝置中利用單細(xì)胞的電穿孔研究了干細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)。他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出在微流控裝置中不僅可以高效地轉(zhuǎn)染MSCs，還可以保持細(xì)胞的生存能力和對(duì)其生存環(huán)境改變作出反應(yīng)的能力。這對(duì)于比較稀少且作為有限的人類(lèi)生命源泉的MSCs來(lái)說(shuō)，是非常重要的。通過(guò)呈現(xiàn)細(xì)胞微環(huán)境中的生長(zhǎng)因素和對(duì)細(xì)胞內(nèi)部蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)高分辨率的成像，可達(dá)到操縱單個(gè)細(xì)胞的目的。
微流控芯片上的單細(xì)胞電穿孔可以避免大量電穿孔時(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)染的和沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合在一起后的分離，這樣也就沒(méi)有必要去鑒別細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染。同時(shí)，單細(xì)胞電穿孔對(duì)細(xì)胞的損傷更小，并且所用細(xì)胞和反應(yīng)試劑的量也更少。而微流控芯片可以用于單個(gè)細(xì)胞的獲取和阻抗的測(cè)量[47-48]，利用微電極的電阻抗微芯片可以有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程的評(píng)估[49]。不僅如此，微流控芯片還可以將靶細(xì)胞定位在特定位點(diǎn)上[50]，利用單細(xì)胞電穿孔技術(shù)操縱組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)中的單個(gè)靶細(xì)胞，從而也為靶細(xì)胞的遺傳、代謝、合成開(kāi)啟了一扇新的窗戶(hù)。
6.微流控條件下細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響因素及改善途徑
長(zhǎng)期以來(lái)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到約束轉(zhuǎn)染效率提高的因素，例如：DNA質(zhì)量的好壞、轉(zhuǎn)染方法的不同等，但在微條件下的相同轉(zhuǎn)染方法中，細(xì)胞包被物[51-52]、流動(dòng)因素[53-54]、微通道寬度、比表面積[23,54]等也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生很大影響。
Uchimura等[51]通過(guò)對(duì)PC12細(xì)胞在微流控芯片上轉(zhuǎn)染的研究，認(rèn)為IV型膠原作為一種合適的表面涂層物對(duì)于PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染得到高的轉(zhuǎn)染效率是非常便利的，而纖連蛋白對(duì)局部轉(zhuǎn)染效率有重要作用。同時(shí)Yoshikawa等[52]通過(guò)對(duì)人體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在微陣列上的轉(zhuǎn)染也發(fā)現(xiàn)纖連蛋白可以明顯提高細(xì)胞在芯片上的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在其細(xì)胞表面包被一層細(xì)胞外基質(zhì)可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率。
在微通道中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞處于懸浮(流動(dòng))，處于固定(靜止)，在這兩種狀態(tài)下轉(zhuǎn)染效率是不一樣的。分子信標(biāo)在靜態(tài)的微通道中的轉(zhuǎn)染效率要比傳統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)皿中的低[54]。在流動(dòng)狀態(tài)下會(huì)受到其他一些因素的影響。為此，Li等[53]通過(guò)模擬計(jì)算和試驗(yàn)兩種方式比較了在傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)皿中和微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有或沒(méi)有流動(dòng)因素對(duì)分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染效率的影響。通過(guò)對(duì)比細(xì)胞培養(yǎng)皿和靜態(tài)的微流控系統(tǒng)中細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，得出分子信標(biāo)的轉(zhuǎn)染受制于擴(kuò)散和反應(yīng)；而對(duì)微流控系統(tǒng)施以一定的范圍的流體剪應(yīng)力和傳質(zhì)速率后，較大的流體剪應(yīng)力會(huì)破壞轉(zhuǎn)染試劑/分子信標(biāo)混合物與細(xì)胞膜的結(jié)合，并且占主導(dǎo)作用以至于超過(guò)加強(qiáng)的傳質(zhì)。也就是說(shuō)，在靜態(tài)的微通道中，每個(gè)細(xì)胞可用的轉(zhuǎn)染試劑/分子信標(biāo)混合物的量會(huì)由于微通道高度的限制而少于傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中的量，因而轉(zhuǎn)染效率也低。而在流動(dòng)的微通道中，流體剪應(yīng)力會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染起負(fù)面作用，因?yàn)榱黧w剪應(yīng)力能夠去除掉細(xì)胞膜表面的轉(zhuǎn)染試劑/分子信標(biāo)混合物，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。
利用電穿孔芯片技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，需要注意所使用的脈沖電壓。當(dāng)使用指數(shù)衰退型脈沖電機(jī)時(shí)，電轉(zhuǎn)染會(huì)受到微通道寬度的影響，因?yàn)殡妷好}沖的波形會(huì)受影響而變化[13-14]。而在微通道中比表面積相對(duì)較大，所以可以使每個(gè)單位表面的熱量更快地分散[23]。這可以盡量減少細(xì)胞的死亡，以余存更多的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，提高總轉(zhuǎn)染效率。
除此之外，將DNA與磁性納米粒子結(jié)合可以在磁場(chǎng)條件下被吸引到細(xì)胞表面的特定區(qū)域，從而可以大大提高該特定區(qū)域的DNA的濃度。相對(duì)于電場(chǎng)條件下的靜電吸引力，磁電穿孔中的磁引力可以有更高的轉(zhuǎn)運(yùn)效率(63.5％對(duì)沒(méi)有任何引力時(shí)的31.45％)，這樣轉(zhuǎn)染效率也就大大提高[7]。同樣，用21個(gè)堿基巰基寡核苷酸修飾的金納米顆粒做運(yùn)輸載體，不但可以用紫外線(xiàn)來(lái)檢測(cè)運(yùn)輸效率，并且在電穿孔中結(jié)合有納米顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)效率也相對(duì)更高[55]。
相似的是合理利用電場(chǎng)也會(huì)有如上磁場(chǎng)的效果。利用圖3c中的微流控裝置，當(dāng)正極連通其中的一個(gè)電極后，DNA由于帶負(fù)電荷所以會(huì)被吸引積聚到陽(yáng)極上，也就增加了這個(gè)電極的DNA濃度，然后再打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)進(jìn)行電穿孔。這也就是通過(guò)電場(chǎng)吸引力將DNA引到特定位點(diǎn)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，如此細(xì)胞表面的DNA濃度會(huì)達(dá)到普通電穿孔的數(shù)千倍，進(jìn)而基因轉(zhuǎn)染效率相比沒(méi)有電場(chǎng)吸引力的6.3倍之高。這種方法對(duì)基因治療的特定位點(diǎn)的基因修復(fù)提供了一個(gè)研究平臺(tái)[43]。
7結(jié)語(yǔ)
將微流控技術(shù)與生命科學(xué)中的熱點(diǎn)結(jié)合起來(lái)研究是現(xiàn)在的一個(gè)趨勢(shì)，相對(duì)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法，利用微流控技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的。首先，比傳統(tǒng)的方法耗費(fèi)溶劑和反應(yīng)試劑量少，并且所需細(xì)胞樣體積也非常小，這對(duì)于某些較難得到的細(xì)胞來(lái)說(shuō)是非常重要的，而轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率也相對(duì)較高。其次，微流控環(huán)境更接近于細(xì)胞的直徑大小，有利于單個(gè)細(xì)胞研究，而這種微環(huán)境也可以有效模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，對(duì)研究細(xì)胞及其小生境或是細(xì)胞在體外的分離培養(yǎng)有重要意義。再次，微流控環(huán)境可以進(jìn)行原位可視觀(guān)察和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)于整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程可以有更好的把握，進(jìn)而有利于轉(zhuǎn)染機(jī)制的研究。最后，利用微流控技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以與微流控技術(shù)中的其他許多技術(shù)相結(jié)合，如細(xì)胞操縱[10,16,36]、細(xì)胞傳感[56]、PCR反應(yīng)[57]及電泳[58]等。
總之，微流控技術(shù)帶來(lái)了巨大的多功能性，它能夠促進(jìn)傳統(tǒng)細(xì)胞生物研究和基因組數(shù)據(jù)的整合，為系統(tǒng)的基因研究提供研究平臺(tái)，并在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域帶來(lái)新的啟示和重要應(yīng)用。
文獻(xiàn)鏈接：
徐海明，蔣稼歡.微流控技術(shù)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),ISSN 1000-3061
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