單細胞蛋白質組學（SCP）通過分析單個細胞、其生物學狀態和信號激活后的功能結果來揭示表型異質性，而這些特征很難通過其他組學特征來探測。這對研究人員來說很有吸引力，因為它能夠更全面地了解細胞過程、疾病發生和進展背后的生物學細節，并促進從單個細胞中識別獨特的生物標志物。基于微流體的策略已成為單細胞分析的首選方法，因為它們允許簡單的檢測集成，如細胞分選、操作和含量分析。值得注意的是，它們一直是一種使能技術，可以提高最近開發的SCP方法的靈敏度、魯棒性和可重復性。微流體技術的關鍵作用預計將在推進SCP分析的下一階段進一步迅速擴大，以揭示更多的生物學和臨床見解。在這篇綜述中，我們將捕捉到微流體方法在靶向和全局SCP方面的最新成就，包括提高蛋白質組覆蓋率、最大限度地減少樣本損失、提高多路復用性和吞吐量的努力。此外，我們將討論SCP的優勢、挑戰、應用和未來前景。

1.導言

復雜的生物系統受到單個細胞動態變化的調節，包括細胞類型及其生物狀態，以及它們與細胞微環境的相互作用。在許多情況下，群體的常規集合測量不能代表單個細胞的確切狀態，因為它平均了不同細胞之間的差異。這種異質性對正常和病理樣本的影響促使在基因組、轉錄組和蛋白質組水平上進行單細胞分析。基于組學的分子圖譜在單細胞水平上的出現是最近生物學研究中最重要的突破之一。在過去的二十年里，基因組學和轉錄組學的技術進步逐步推進，由于遺傳擴增的可行性，能夠從單個細胞中表征整個基因組和轉錄組。雖然最近的報告表明蛋白質組圖譜與mRNA表達相關性較差，但由于缺乏擴增策略和蛋白質組的廣泛動態范圍，分析單個細胞的蛋白質組一直具有挑戰性。為了闡明翻譯過程中缺失的推理，有必要對蛋白質進行全面表征，以補充單細胞水平的遺傳測量。

單細胞蛋白質組學（SCP）是一個快速發展的研究領域，其在研究生物系統中的應用揭示了關于同基因細胞間表型和同一細胞內細胞過程的大量關鍵見解。SCP分析主要作為靶向和非靶向（全局）方法開發。基于標記的親和探針（如抗體），采用靶向方法檢測分泌和細胞內蛋白質。另一方面，質譜（MS）是全球蛋白質組學分析的主要儀器，已被廣泛用于從大樣本中提取接近完整的蛋白質組。然而，在使用傳統的蛋白質組學制備工作流程時，MS的可行性和靈敏度在單細胞水平上受到了嚴重損害。

為了解決這些局限性，人們付出了巨大的努力來實現樣品制備的小型化、分析工作流程的優化和儀器的集成，旨在實現更簡化的SCP協議，同時將樣品損失降至最低。特別是微流體，非常適合并應用于此類工作。它是一個多學科平臺，用于將納米到毫微微升的流體樣品精確處理、觀察和加工到所需的微工程隔室中。此外，基于微流體的方法具有成本效益分析、樣品和試劑消耗低、反應動力學增加和接觸面積減少的內在特性，從而產生更靈敏的檢測結果。在過去的十年中，微流體系統作為多任務平臺蓬勃發展，通過多功能集成、多路復用能力和最大化吞吐量，可以促進單細胞研究（圖1）。使用微流體系統的整個蛋白質組學工作流程可以在幾納升的體積內進行（例如一鍋協議），大大減少了樣品損失。然而，盡管如此，由于整體系統集成、所需的蛋白質組覆蓋率和所需的靈敏度，使用MS和微流體的SCP研究仍然具有挑戰性，例如檢測從高豐度到低拷貝數的蛋白質。由于異質單個細胞表達由內在和外在因素引發的獨特蛋白質組，它們在臨床醫學進步和更廣泛的細胞生物學探索中的作用必須由SCP技術來解決。很少有評論討論基于微流體策略的SCP發展，但他們的大部分重點要么是多組學方法（很少強調基于MS的SCP），要么是微流體技術的基礎。在這篇綜述中，微流體的最新發展。將系統地討論基于SCP的SCP，包括其獨特的特征、優勢、局限性、應用和未來前景。我們將介紹微流體和單細胞蛋白質靶向分析的能力，然后詳細描述基于MS的全球SCP分析的最新微流體方法，特別關注樣品制備的小型化、增強的蛋白質組深度以及這些方法所揭示的生物信息。最后，我們將討論推進SCP領域的挑戰和機遇。

2.用于生物分子分析的微流體技術發展到單細胞水平

從歷史上看，微流體器件的誕生與微電子和半導體器件制造的開始相關。自從第一個芯片實驗室器件被證明是一個小型化的色譜系統以來，已經開發了25種不同的微流體系統，如全化學分析系統（TAS）、液滴微流體、數字微流體和許多其他系統，以滿足各自的研究需求。在值得注意的發展中，G.Whitesides等人引入了軟光刻微圖案技術，該技術允許使用彈性體材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）使用復制模制造圖案轉移元件。隨后，S.Quake等人應用軟光刻技術制造多層通過嵌入式閥門和蠕動泵實現定制流體控制的微流體。從那時起，微流體系統在生物工程、生物醫學科學、，為了進一步將生物分子敏感性降低到單細胞水平，減少試劑消耗和有效收集細胞內容物起著關鍵作用。在以下部分中，討論了細胞處理的一些選定工作，包括細胞分離、操作、裂解以及與下游儀器的微流體接口。

2.1用于細胞處理的微流體裝置

單細胞方法要求在后續樣品處理之前分離單個細胞。因此，細胞處理技術已被納入各種微流體平臺進行生物研究。下面簡要討論了典型的單細胞方法，包括液滴、微柱、微孔和集成閥阱。在液滴微流體中，通過在不混溶的載液中分割形成液滴的水流，將單個細胞與其他試劑一起包裹起來（圖2a（i））。通過調節不混溶流體的不同流速來控制液滴大小，從而在幾秒鐘內產生數千個液滴。微柱陣列利用形態陷阱來限制細胞的運動，從而在細胞懸浮液流過時捕獲它們。細胞捕獲通常需要幾十秒，微柱可以進行化學功能化以提高效率和選擇性（圖2a（ii））。個用于細胞捕獲的微孔通過將孔模制成與靶細胞大小相當的尺寸來利用尺寸依賴的捕獲。開放式井制造的便利性提供了可調節的可擴展性和功能性，這對于高通量工作流程來說是理想的（圖2a（iii））。另一種方法利用壓力控制閥，結合微通道電路來捕獲細胞。這種方法允許在同一芯片上集成一系列操作，實現自動化和并行化（圖2b（iv））。除了上述方法外，還應用了額外的功能，如聲學（圖2b（i））、光鑷（圖2b（ii））、磁學（圖2b，iii）、介電電泳（圖2b，iv），以促進細胞處理和按需分選。這些細胞分選技術利用外部力場來偏轉靶細胞在通過微通道時的流動路徑。由于芯片設計的靈活性，基于微流體的單細胞方法易于集成到下游的細胞操作和分析中，這是大多數現成的細胞分選儀器無法提供的功能。

2.2細胞裂解微型裝置

為了最大限度地提高分析靈敏度，能夠有效提取細胞內內容物的細胞裂解方法非常重要。因此，多種微流體已被證明可用于片上細胞裂解。Chen等人制作了一種三層結構（PMMA硅片PDMS），用于預處理大鼠全血，并通過基于洗滌劑的裂解在50分鐘內從白細胞中提取PCR可擴增DNA。Irimia等人協調了帶有閥門的熱氣動執行器，在微室中混合單細胞懸浮液和微裂解洗滌劑（25 pL），通過沿液氣界面的虛擬壁抽出空氣來實現細胞裂解。Sasuga等人提出了另一種在pL級微孔上進行的化學裂解。這種方法遵循典型的基于微孔的細胞操作，其中裂解試劑通過流動池（在PDMS板和由雙面膠帶粘合的玻璃蓋玻片之間），以允許單細胞測量細胞內蛋白質。同時，為了避免樣品清理步驟，使用微流體裝置開發了無洗滌劑的裂解方法，如通過機械（圖2c（i））、激光（圖2c 為了實現熱解，在硅基底上沉積了一個溫度傳感器和一個微型鉑加熱器。此外，還配備了無線感應加熱器來加熱大面積的表面，一次可以處理大量的樣品（圖2c（iii））請注意，上述微流體促進的細胞裂解方法不一定用于蛋白質組學研究，盡管如此，它們可能會改善SCP分析。總的來說，微流體使用不同的模式提供了受控的裂解能力，這些模式可以根據單細胞測定進行調整。更重要的是，該功能可以很容易地與微流體中的現有功能模塊集成，以構建簡化的工作流程，避免樣品損失（由于樣品轉移），從而提高靈敏度。

2.3微流體與下游檢測技術的集成

成功地將微流體與分析技術相結合，如基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）和液相色譜質譜（LC-MS），提高了蛋白質組學分析對質量有限樣品的靈敏度。潘等人開發了一種單探針，這是一種直接與質譜儀耦合的小型化接口設備。這種方法省去了標準質譜樣品制備，并與質譜入口兼容，允許實時單細胞質譜分析。此外，為了應對電離性較差的樣品的挑戰，Huang等人引入了配備三合一設置（即取樣、溶劑注入和ESI）的雙探針微芯片（圖2d（i））。在大多數基于質譜的蛋白質組學分析中，通常需要超高壓樣品分離，以提高質譜讀數的分辨率并縮短分析時間；然而，這一特征通常會導致微流控芯片故障和連接器泄漏。為了解決這個問題，Eeltink的團隊最近開發了一種微流體調制器芯片，用于與高壓LC操作（高達65 MPa）對接。同樣，Chen等人還提出了一種耐高壓的3D打印多層微流體芯片，可以在LC-MS系統中在13.4 MPa的背壓下運行。接口芯片有兩個入口，一個連接到LC，另一個用于顆粒填充，一個出口連接到質譜儀（圖2d（ii））。總的來說，將功能模塊集成到微流體中并將其直接與LC-MS系統耦合的努力在簡化工作流程方面具有誘人的前景，可以顯著減少樣品損失并提高分析靈敏度。為單細胞蛋白質組學開發的方法在所需的靈敏度和更深入的蛋白質組學覆蓋方面還處于早期階段。下一節將討論靶向和全球蛋白質組學技術的持續進展。

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