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透氧熱塑性塑料聚甲基戊烯在長(zhǎng)期芯片細(xì)胞培養(yǎng)和芯片有機(jī)器件中的應(yīng)用(上)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)和分析,研究了透氣性熱塑性材料聚甲基戊烯(PMP)在芯片有機(jī)物(OoC)和長(zhǎng)期芯片細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的適用性。我們使用裝有氧傳感器的密封培養(yǎng)室裝置,測(cè)試并比較了PMP與常用的玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。我們發(fā)現(xiàn),與玻璃對(duì)照組相比,PMP和PDMS在4天的上皮(A549)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中具有相當(dāng)?shù)墓┭跣阅埽鯕鉂舛确€(wěn)定在16%,而玻璃對(duì)照組的氧氣濃度降至3%。首次獲得了生長(zhǎng)在PMP上的細(xì)胞的透射光圖像,證明PMP的光學(xué)特性適用于非熒光活細(xì)胞成像。在結(jié)合透射光成像和鈣黃綠素AM染色后,A549細(xì)胞的細(xì)胞粘附、增殖、形態(tài)和存活率在PMP和涂有聚-L-賴(lài)氨酸的玻璃上顯示相似。與PDMS相比,我們證明了薄至0.125mm的PMP薄膜因其優(yōu)異的光學(xué)性能和機(jī)械剛度而與高分辨率共聚焦顯微鏡兼容。PMP還被發(fā)現(xiàn)與設(shè)備滅菌、細(xì)胞固定、細(xì)胞通透性和熒光染色完全兼容。我們?cè)O(shè)想這種材料可以擴(kuò)展目前最先進(jìn)的微流體應(yīng)用范圍,因?yàn)樗哂杏幸娴奈锢硖匦院瓦m用于不同方法的原型制作。這項(xiàng)工作中展示的集成設(shè)備和測(cè)量方法可以轉(zhuǎn)移到其他基于細(xì)胞的研究和生命科學(xué)應(yīng)用中。

1.導(dǎo)言

片上組織(OoC)是一個(gè)快速發(fā)展的研究領(lǐng)域,有可能在體外復(fù)制人體生理學(xué)的關(guān)鍵方面,從而成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、藥物篩選以及器官功能和疾病病理生理學(xué)研究的創(chuàng)新平臺(tái)。人們對(duì)新型材料和技術(shù)的興趣和需求日益增長(zhǎng),這些材料和技術(shù)可以在OoC和芯片實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)中保留天然細(xì)胞環(huán)境,用于長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)研究。根據(jù)應(yīng)用需要不同的材料性能組合,這反映在最近報(bào)道的用于制造OoC器件的各種不同材料中。這包括彈性體(如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、SU-8聚合物、聚酯彈性體和熱塑性彈性體)、熱塑性塑料(如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物(COC)、聚苯乙烯(PS))、天然聚合物(如膠原蛋白、纖維蛋白、藻酸鹽和透明質(zhì)酸)、混合材料(如PEG纖維蛋白原和PLA殼聚糖明膠)、粘合劑和環(huán)氧樹(shù)脂和非化學(xué)計(jì)量硫烯環(huán)氧樹(shù)脂(ostemer))、3D打印樹(shù)脂(如紫外線(xiàn)固化樹(shù)脂、牙科樹(shù)脂和水凝膠)和無(wú)機(jī)材料(如玻璃、硅和陶瓷))。通過(guò)整合多種材料和傳感方法,已經(jīng)投入了許多努力來(lái)擴(kuò)展平臺(tái)的功能。然而,由于各種材料限制,這些平臺(tái)通常仍會(huì)影響細(xì)胞實(shí)驗(yàn),并可能禁止不同實(shí)驗(yàn)室之間直接比較結(jié)果。在這項(xiàng)工作中,我們展示了熱塑性材料聚甲基戊烯(PMP)在長(zhǎng)期片上細(xì)胞培養(yǎng)中的新應(yīng)用,將其與玻璃和PDMS(片上細(xì)胞研究中常用的兩種材料)進(jìn)行了比較,并為細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備中的氧氣供應(yīng)和氧氣監(jiān)測(cè)集成提供了理論和實(shí)驗(yàn)見(jiàn)解。

1.1.培養(yǎng)細(xì)胞的氣體和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)

在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和在OoC設(shè)備內(nèi)的密閉空間中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),持續(xù)獲得必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體是培養(yǎng)細(xì)胞的必要條件。在傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)中,定期更換培養(yǎng)基以輸送營(yíng)養(yǎng)并去除細(xì)胞產(chǎn)生的廢物。同時(shí),分泌的可溶性因子也被去除。氣體供應(yīng)是通過(guò)從周?chē)諝馔ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基擴(kuò)散來(lái)提供的,因此是連續(xù)的。所有細(xì)胞都需要持續(xù)的氧氣供應(yīng),在用碳酸氫鹽緩沖液配制的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞也需要周?chē)諝庵?%的二氧化碳,以產(chǎn)生7.0-7.4的生理pH值。缺乏適當(dāng)?shù)难鯕夤?yīng)會(huì)通過(guò)激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)家族的蛋白質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重大影響,HIF家族可以在低氧條件下重寫(xiě)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序。特別是,HIF-1在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用,如增殖、凋亡、葡萄糖代謝、蛋白水解等。 .HIF-1目前因其在腫瘤低氧微環(huán)境中的細(xì)胞存活中的作用而引起了許多研究人員的關(guān)注。

1.2.微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置中氣體供應(yīng)的解耦

對(duì)于用玻璃等不透氣材料和PMMA、PC、COC和PS等常見(jiàn)熱塑性塑料制成的OoC和細(xì)胞培養(yǎng)裝置,培養(yǎng)基的灌注是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體的唯一供應(yīng)來(lái)源,也是去除廢物和分泌的可溶性因子的唯一來(lái)源。然而,介質(zhì)灌注也會(huì)對(duì)細(xì)胞施加顯著的流體剪切應(yīng)力,導(dǎo)致不希望的細(xì)胞類(lèi)型特異性和剪切應(yīng)力水平特異性反應(yīng)。除非正在研究剪切應(yīng)力本身的影響,否則將灌注流速以及剪切應(yīng)力保持在盡可能低的水平是有益的。Bunge等人比較了細(xì)胞消耗或產(chǎn)生的重要化合物(葡萄糖、乳酸、銨和氧氣),發(fā)現(xiàn)氧氣的交換頻率是其他化合物的10倍。因此,氣體供應(yīng)與介質(zhì)灌注分離的設(shè)備非常有益。此外,從實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋旧淼慕嵌葋?lái)看,持續(xù)的培養(yǎng)基交換也可能是非常不理想的,因?yàn)樗€會(huì)從細(xì)胞附近去除正在研究的未結(jié)合化合物(例如細(xì)胞因子)。在處理非貼壁細(xì)胞、細(xì)菌或病毒時(shí),灌注流量也可能存在問(wèn)題。

1.3.PDMS材料在細(xì)胞培養(yǎng)和Ooc設(shè)備中的應(yīng)用

氣體供應(yīng)的解耦是透氣彈性體材料PDMS如此常用于制造用于細(xì)胞培養(yǎng)的微流體裝置的主要原因之一。Bunge等人比較了用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的微流控裝置,在列出的18個(gè)裝置中,有13個(gè)裝置的氣體是通過(guò)PDMS擴(kuò)散供應(yīng)的。其他裝置依賴(lài)于用溶解氣體灌注介質(zhì),通過(guò)水凝膠或開(kāi)放式儲(chǔ)器擴(kuò)散。Wu等人回顧了用于體外控制氣體微環(huán)境的微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置,發(fā)現(xiàn)在列出的36個(gè)裝置中,有34個(gè)至少部分是在PDMS中制造的。

PDMS作為一種研究工具具有一些有利的特性,因?yàn)樗试S快速廉價(jià)的原型制作,易于與玻璃粘合,以及有利的光學(xué)特性和可變形性,允許集成片上泵和閥。然而,由于其多孔性和疏水性,它也會(huì)吸收小的疏水分子,這會(huì)影響疏水性藥物和激素等重要溶質(zhì)的濃度。其高透水性導(dǎo)致水從PDMS微流體回路中蒸發(fā),并可能導(dǎo)致氣泡形成和滲透壓變化。PDMS的其他特性代表了基于細(xì)胞的研究的挑戰(zhàn),包括未交聯(lián)低聚物的浸出,血漿親水化后的疏水性恢復(fù),這限制了保質(zhì)期,以及高柔量導(dǎo)致微通道變形。此外,很明顯,基于PDMS的設(shè)備的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化受到了擴(kuò)大規(guī)模困難和低制造吞吐量的阻礙。因此,需要確定用于制造透氣OoC器件的新材料。

1.4.用于長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)研究的PMP材料

作為體外膜肺氧合系統(tǒng)中使用的一種氣體可滲透的熱塑性材料,材料PMP可能是一種很有前途的替代品,能夠在用于長(zhǎng)期細(xì)胞研究的設(shè)備中控制氧氣。PMP,也稱(chēng)為T(mén)PXTM(透明聚合物X),是Mitsui Chemicals,股份有限公司的商標(biāo),是一種具有特征分子結(jié)構(gòu)的4-甲基戊烯-1-基烯烴共聚物。分子的低堆積密度導(dǎo)致非常高的氣體滲透性,使PMP與其他幾乎不透氣的熱塑性塑料截然不同。然而,迄今為止,PMP在用于細(xì)胞培養(yǎng)和OoC的微流體裝置中幾乎沒(méi)有得到探索。

Knoepp等人創(chuàng)建了一個(gè)基于PMP的微流體系統(tǒng),用于同時(shí)進(jìn)行拉曼光譜、膜片鉗電生理學(xué)和活細(xì)胞成像,以研究單細(xì)胞對(duì)急性缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞事件。該裝置在PMP中研磨,并附著在具有較低玻璃底部的商業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)皿上。在這項(xiàng)工作中選擇PMP是有益的,因?yàn)樗鼘?duì)目標(biāo)生物標(biāo)志物的拉曼光譜幾乎沒(méi)有干擾。Ochs等人開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算模型,用于預(yù)測(cè)已知透氧性的微流體裝置和具有已知吸氧行為的細(xì)胞類(lèi)型中的氧氣水平。該模型是使用微流體結(jié)構(gòu)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的,這些微流體結(jié)構(gòu)要么是在COC或PMP中注塑成型的,要么是在PDMS中成型的,這些結(jié)構(gòu)附著在商業(yè)氧傳感器箔上。當(dāng)貼壁細(xì)胞在傳感器箔上生長(zhǎng)時(shí),監(jiān)測(cè)設(shè)備內(nèi)的氧氣水平兩個(gè)小時(shí)。盡管這些研究顯示了有希望的結(jié)果,但關(guān)于PMP在長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備中的使用,還有很多研究要做,例如在細(xì)胞培養(yǎng)的幾天內(nèi)進(jìn)行氧氣監(jiān)測(cè),以及在設(shè)備內(nèi)PMP材料本身上培養(yǎng)和成像貼壁細(xì)胞。在Knoepp等人和Ochs等人[23]的先前工作中,裝置的細(xì)胞粘附部分是由其他材料制成的。

在這里,我們對(duì)用于長(zhǎng)期芯片細(xì)胞培養(yǎng)和OoC應(yīng)用的設(shè)備的PMP材料的性能進(jìn)行了研究。評(píng)估包括與玻璃相比的細(xì)胞粘附、增殖和形態(tài)的調(diào)查,細(xì)胞透射光和熒光共聚焦顯微鏡的適用性,與常見(jiàn)化學(xué)物質(zhì)的相容性,設(shè)備制造以及在沒(méi)有灌注的情況下在密封設(shè)備中培養(yǎng)4天的細(xì)胞供氧氣體滲透性。為了評(píng)估PMP在這種環(huán)境下的透氣性能,我們開(kāi)發(fā)了一種帶有隔離、封閉培養(yǎng)室的設(shè)備,該培養(yǎng)室裝有氧氣傳感器,可以直接比較PMP和對(duì)照材料玻璃和PDMS(圖1)。封閉的、氧氣監(jiān)測(cè)的培養(yǎng)室充當(dāng)模塊,通過(guò)將培養(yǎng)室、合適的微流體通道網(wǎng)絡(luò)和芯片到世界的接口組合在一個(gè)單一的設(shè)計(jì)中,可以用作形成復(fù)雜的OoC甚至具有受控氧氣環(huán)境的片上身體設(shè)備的構(gòu)建塊。

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原型制作方法(即銑削)和適用于大規(guī)模制造的技術(shù),如注塑都適用于PMP。這對(duì)于這種材料在醫(yī)學(xué)和制藥研究以及商業(yè)應(yīng)用中的可重復(fù)性來(lái)說(shuō)是一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)工作的目的是證明PMP在長(zhǎng)期微流體細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備中的潛力,并為對(duì)熱塑性塑料基透氧細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備感興趣的學(xué)術(shù)和工業(yè)界提供一種替代方案。

2.材料和方法

2.1.細(xì)胞和培養(yǎng)條件

A549細(xì)胞最初購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。它們?cè)谔砑恿?0%胎牛血清和青霉素/鏈霉素抗生素溶液的F12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37°C,5%CO2)在ThermoFisher系列8000 WJ培養(yǎng)箱中培養(yǎng),達(dá)到90%融合后每2-3天傳代一次。

2.2.培養(yǎng)箱裝置的設(shè)計(jì)與制作

2.2.1.集成氧傳感器培養(yǎng)箱裝置的設(shè)計(jì)

培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)是為了測(cè)試PMP的適用性,而不會(huì)因不必要的設(shè)計(jì)復(fù)雜性而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2所示的設(shè)備用于氧氣測(cè)量(第2.3節(jié))和Hif1α染色。每個(gè)裝置由一個(gè)容納細(xì)胞培養(yǎng)室的基板(圖2中從頂部起的第二層)和一個(gè)蓋子(頂層)組成,兩者都在PC中研磨。每個(gè)基板都有兩個(gè)腔室,用于實(shí)驗(yàn)中的技術(shù)復(fù)制。設(shè)計(jì)了三種不同的設(shè)備變體,在基板下方集成了不同的材料,以獲得PMP實(shí)驗(yàn)的充分控制:(1)帶有PMP薄膜的設(shè)備(“傳感器/PMP”)(圖2a);(2)帶玻璃蓋玻片的裝置(“傳感器/玻璃”)(圖2b);以及(3)帶有PDMS薄膜的設(shè)備(“傳感器/PDMS”)(圖2c)。腔室直徑為6.4 mm,與常規(guī)96孔板中的孔直徑相似,高度為4 mm。蓋子的設(shè)計(jì)符合基板的輪廓,一個(gè)圓形腔體(內(nèi)徑10 mm,外徑13.6 mm,深度1.2 mm)用于插入10×1.5 mm2的硅膠O型圈(Otto Olsen,Skedsmokorset,Norway),確保了用螺釘固定時(shí)基板和蓋子之間的緊密密封。使用硅膠Dowsil SG2 734將直徑為3 mm的氧敏感點(diǎn)SP-PSt3-NAU-D3-YOP粘到蓋子上,將其定位在組裝好的裝置中腔室的頂部中心。位于氧傳感器點(diǎn)上方1毫米處的圓形插座設(shè)計(jì)用于容納光纖,以讀取敏感點(diǎn)的信號(hào)。對(duì)于PDMS,除了PSA外,還使用了在PC中銑削的支撐夾板,如圖2c所示。PSA和PDMS之間的粘合強(qiáng)度不夠,因此需要額外的機(jī)械夾緊。

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2.2.2.無(wú)氧傳感器培養(yǎng)箱裝置的設(shè)計(jì)

為了比較PMP膜和玻璃蓋玻片上的細(xì)胞粘附、增殖和存活率,使用了圖3所示的裝置。與第2.2.1節(jié)所述裝置的唯一區(qū)別是蓋子,蓋子在這里僅作為支撐蓋,以確保無(wú)菌。這些設(shè)備將被稱(chēng)為“非傳感器/PMP”和“非傳感器/玻璃”。

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2.2.3.制造

使用三軸銑床在聚碳酸酯(Lexan)中銑削基板、蓋子和夾板。用異丙醇擦拭研磨后的零件,在去離子水中漂洗,并在去離子水中超聲處理5分鐘。然后將氧敏感點(diǎn)粘在蓋子上,在室溫下干燥24小時(shí)。然后,在空氣中對(duì)18個(gè)傳感器進(jìn)行了表征,發(fā)現(xiàn)平均氧濃度為21.5%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%。厚度為0.125mm、等級(jí)為DX845的商用PMP薄膜ME31110通過(guò)首先用粒徑為3μM、然后為1μM的金剛石拋光劑、DP懸浮液拋光,使其光學(xué)透明,并在去離子水中超聲沖洗。使用PSA將玻璃蓋玻片或PMP膜附著在基板上,使用PSA和夾板將PDMS膜附著在基板。

2.2.4.不同滅菌方法的兼容性測(cè)試

PMP薄膜暴露于以下滅菌化學(xué)品:Aerodesin 2000、70%乙醇和100%甲醇。對(duì)于物理滅菌,PMP薄膜在121°C的高壓釜中暴露于蒸汽滅菌20分鐘,在層流柜中暴露于紫外線(xiàn)30分鐘或等離子體處理。使用配備有13.56 MHz/50 W發(fā)生器的低壓等離子體清潔器進(jìn)行等離子體處理,步驟如下:(1)將工作室中的空氣抽空,并將壓力降至0.1毫巴,(2)向工作室供應(yīng)氧氣(5分鐘,流量10sccm),以及(3)運(yùn)行等離子體處理過(guò)程(50 W,5分鐘),保持氧氣流量為10sccm。

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免責(zé)聲明:文章來(lái)源https://doi.org/10.3390/mi14030532  以傳播知識(shí)、有益學(xué)習(xí)和研究為宗旨。轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息,版權(quán)歸原作者所有,如侵犯權(quán)益,請(qǐng)聯(lián)系刪除。


標(biāo)簽:   微流控芯片 微流控
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