3.結果和討論

3.1.PMP和玻璃細胞形態和增殖的比較

圖5比較了標準玻璃蓋玻片和拋光PMP膜上的細胞培養，兩者在細胞接種前都涂有聚-L-賴氨酸。第一天的圖像顯示，粘附在兩個表面上的細胞數量和細胞粘附開始的時間點相似。通過融合發展判斷的細胞增殖率也是可比的，兩種材料上的細胞形態也是如此。48小時后的鈣黃綠素AM染色證實，在實驗結束時，細胞以相似的數量存活。

由于聚苯乙烯制成的細胞培養板和玻璃蓋玻片是用于細胞培養和成像的最常見材料，因此對可能的新材料進行基準測試非常重要。對于聚苯乙烯孔板和通常的玻璃蓋玻片，PMP也必須進行表面處理以促進細胞粘附。在初步研究中，我們比較了未經治療的PMP、經血漿治療的PMP，經聚-L-賴氨酸治療的PMP和經血漿加聚-L-溶血素治療的PMP。在未經處理的PMP上，細胞幾乎不粘附，細胞形態圓潤收縮。Slepi?ka等人和Michaljani?ová等人也分別對血管平滑肌細胞和小鼠胚胎成纖維細胞（NIH 3T3）進行了觀察。在三種治療中的任何一種的PMP上，細胞粘附、增殖和形態與圖5相似。

等離子體處理通常用于增加聚合物的親水性，從而增加細胞粘附和增殖。它也是制造用于貼壁細胞的商業聚苯乙烯細胞培養板的最常見方法。Slepi?ka等人和Michaljani?ová等人研究了PMP等離子體處理的變體，以提高該材料在組織工程中的細胞相容性。Slepi?ka等人使用低功率（3和8 W）的Ar等離子體，而Michaljanii?ová等人使用高功率的氬或O2/Ar等離子體。其他參數也有所不同。對于所有血漿處理的變體，他們表明，與接觸角約為100°的未處理PMP相比，水接觸角顯著降低，細胞在血漿處理的PMP上成功粘附和增殖，而非未處理的PMP。然而，他們還表明，在等離子體處理后，接觸角在接下來的幾天內再次逐漸向未處理值增加。對于Slepi?ka等人進行的低功率等離子體處理，恢復到更高接觸角的速度比Michaljani?ová等人進行的更高功率等離子體處理快，其中一些樣品保持在60°接觸角至少9天。除水接觸角之外的其他因素也可能影響細胞粘附，需要更多的研究來了解所有實驗參數隨時間的相互作用。對于將PMP用于OoC和長期片上細胞培養，血漿處理產生處理后多年穩定的PMP表面，就像今天商業TCPS板的情況一樣，將是非常有益的。這將簡化芯片實驗室社區工程師和生物學家之間的合作，使實驗更加實用，并允許大規模生產即用型設備。

在這項工作中，由于與實驗工作流程的更好兼容性，聚-L-賴氨酸處理被選為提高PMP細胞相容性的方法。

3.2.透射光和熒光共聚焦顯微鏡的適用性

在用于長期細胞培養和OoC應用的微流體設備中，能夠用顯微鏡連續監測細胞狀態至關重要。由于熒光染色和成像可能因光毒性而隨著時間的推移對細胞有害，并且只能使部分細胞可見，因此透射光顯微鏡是首選的細胞監測方法。圖5表明，在玻璃和PMP上成像時，細胞的外觀相似，因此PMP的光學特性適用于該應用。

商用PMP薄膜被擠出，一面有光澤，一面無光澤。據我們所知，目前市場上還沒有完全透明的PMP薄膜。盡管熒光成像在這些商業膠片上是可行的，但粗糙度較高的亞光面會干擾透射光成像，從而無法進行可靠的細胞觀察。這在補充圖S3中得到了證明。為了獲得適用于顯微鏡的PMP薄膜，應用了亞光側的拋光方法。拋光過程可以進一步優化，以防止由于施加的機械力而偶爾劃傷和彎曲PMP膜。

本文首次報道了在PMP上生長的活細胞的透射光圖像。Slepi?ka等人和Michaljani?ová等人展示了在血漿處理的PMP上生長的細胞的熒光圖像，這些細胞被固定并熒光標記，但沒有伴隨的透射光圖像。Nishikawa等人和Danoy等人分別在I-P型膠原蛋白包被的PMP上培養原代大鼠肝細胞和冷凍保存的原代人肝細胞，以更準確地評估肝細胞代謝和藥物篩選。然而，透射光顯微鏡圖像沒有如本文所示。我們不知道其他在PMP上培養細胞的工作。如上所述，在微流體裝置中細胞培養過程中用于細胞監測的透射光顯微鏡至關重要，因此，我們認為這里提出的結果是闡明PMP適用于片上器官和長期細胞培養裝置的重要一步。

為了詳細研究細胞機制和反應，共聚焦顯微鏡等高分辨率成像技術是必要的。在PDMS中制造的常見微流體細胞培養裝置的一個主要挑戰是，由于材料的高彈性，需要毫米范圍內的裝置厚度來獲得足夠的剛性，以實現穩健的通道幾何形狀。為了進行高分辨率成像，通常需要小于0.3毫米的工作距離，因此毫米厚的PDMS設備是不切實際的。當試樣與蓋玻片直接接觸時，大多數物鏡都設計為與厚度為0.17 mm的玻璃蓋玻片（蓋玻片#1.5）一起工作。在我們的工作中，我們使用了厚度最接近此厚度且薄至0.125 mm的市售PMP薄膜。由于PMP是一種熱塑性材料，即使在這種厚度下，其剛度也適合構成堅固、平坦的通道壁，從而允許共聚焦顯微鏡，如圖5所示。根據制造商Mitsui Chemicals，股份有限公司的說法，PMP像玻璃一樣透明，對可見光具有優異的透過率（>93%；霧度<5%）。此外，PMP在紫外線范圍內顯示出比玻璃更好的透射率?？傊琍MP似乎非常適合細胞成像，以及更專業的高分辨率成像技術，如共聚焦顯微鏡。

3.3.與細胞培養和顯微鏡樣品制備常用化學品的兼容性

用于細胞培養的微流體裝置中的材料的另一個重要特征是與細胞實驗中使用的常見化學物質的相容性。由于其穩定的C-C鍵，PMP顯示出優異的耐化學性，特別是對酸、堿和醇的耐受性。PMP暴露于4%甲醛和0.1%Triton X-100進行細胞固定和滲透，此外還暴露于Aerodesin 2000、70%乙醇和100%甲醇進行滅菌。Aerodesin 2000由32.5重量%的丙-1-醇、18重量%的乙醇和0.1重量%的戊二醛組成。我們沒有觀察到PMP薄膜在暴露于任何這些化學物質后有任何明顯的劣化，也沒有觀察到其透明度有任何變化。這同樣適用于所測試的物理滅菌方法，即等離子體處理、紫外線照射和蒸汽滅菌。事實上，PMP是一種注定要用于需要蒸汽滅菌的應用的材料，因為吸水率非常低，因此無法觀察到水解引起的尺寸變化。

圖6顯示了除DAPI核染色外，用抗HIF-1α抗體和Alexa 488標記的二抗固定、滲透和熒光標記的細胞的共聚焦圖像。這證明了PMP材料與固定和滲透化學物質的相容性及其對熒光成像的適用性。DAPI和Alexa 488熒光分別在358/461 nm和488/520 nm處具有激發/發射最大值；然而，根據三井化學股份有限公司的說法，PMP的透明度應允許在整個可見光范圍內獲得與玻璃類似的結果，并且在紫外線范圍內具有比玻璃更好的透射性。如圖5和圖6中的熒光圖像所示，我們沒有觀察到任何熒光團與PMP膜的非特異性結合。基于此，我們可以得出結論，PMP在化學相容性方面適用于長期微流控細胞培養裝置。

3.4.設備制造

在這項工作中，實驗需要一種裝置，其中氣體流入受到透氣底壁的限制，而裝置的其余部分則由不透氣材料（PC）制成。為此，使用PSA手動對齊PMP薄膜并將其與銑削的PC基板層壓在一起（圖2）。這種簡單的原型制作方法產生了功能良好的概念驗證設備。然而，對于許多OoC應用，需要在PMP中制造整個器件，因此，需要替代的制造和粘合方法，例如銑削和注塑。

3.5.足夠的氣體滲透性以維持密封裝置中的細胞培養，而無需灌注培養基

在實驗過程中，每天至少兩次通過顯微鏡監測細胞生長。由于氧傳感器點覆蓋了腔室的中心，因此在密封設備時只能監測腔室外圍的細胞，但在實驗結束時（第四天），打開設備檢查整個細胞培養區域。所有設備中細胞融合的發展情況相似，表明玻璃設備與PMP和PDMS設備中O2濃度的差異不是由PMP和PDSS設備中細胞數量較低引起的。

所有三種設備中O2濃度的趨勢都很明顯，并且隨時間的波動很小。在圖7中，繪制了實驗精確測量值的平均值和標準偏差。因此，結果中存在相對較大的標準偏差，特別是在帶有玻璃蓋玻片的設備的第一天。然而，相對較大的標準偏差不是由同一室內O2濃度的時間依賴性波動引起的，而是由實驗重復之間的差異引起的。

經過四天的細胞培養和O2濃度監測，打開所有裝置，固定細胞，使其透性，對HIF-1α進行染色并檢查（圖6）。我們觀察到在帶有玻璃蓋玻片的設備中生長的許多細胞中HIF-1α的激活，根據O2濃度測量，實驗結束時氧濃度降至約3%。在含有PMP的設備中生長的細胞中看不到這種激活，最終測量的氧濃度達到16%。這與Uchida等人的研究結果一致，其中在氧氣濃度降低的范圍內，A549細胞中HIF-1α的水平在氧氣濃度為3%時首先上升。由于夾板阻礙了顯微鏡物鏡的進入，因此無法在帶有PDMS薄膜的設備中獲得細胞的共聚焦圖像。

盡管PMP膜在當前的工作中提供了足夠的氣體供應，但這并不一定意味著這適用于用于微流體細胞培養和OoC的所有設備幾何形狀和細胞類型。根據Wagner等人的研究，哺乳動物細胞在培養中的氧氣利用率范圍為<1至350 >amol cell-1 s-1，取決于細胞類型、功能和生物學狀態。根據同一篇論文，本研究中使用的A549細胞的OCR為27 amol cell?1 s?1。每單位面積的細胞數量取決于細胞大小、生長特性，重要的是該設備是用于2D還是3D培養。PMP中氧氣的滲透性可能因不同等級的PMP而異，并可能受到聚合物原型方法的影響。裝置幾何形狀，即壁厚和由透氣PMP制成的裝置的百分比，在不同的應用中也可能存在很大差異。因此，需要更多的研究來進一步研究PMP對不同細胞類型、細胞培養形式和微流體裝置幾何形狀的適用性。Ochs等人的工作中發現了不同細胞類型影響的一個例子，其中測量了結合到不透氣氧氣傳感器箔上的2毫米厚COC、PMP和PDMS器件中的氧氣濃度。對于內皮細胞，PMP和PDMS裝置的氧氣濃度均保持在15-16%，而在COC中，氧氣濃度在監測的2小時內降至12%。對于肝細胞，只有PDMS裝置維持了16%的氧氣，而PMP和COC裝置在2小時內分別降至9%和4%。

為了更好地了解本項目開發的培養室模塊中不同細胞類型的PMP氣體供應是否充足，進行了分析。使用補充信息中提供的通過培養基（1）和PMP材料（2）的氧氣通量方程，我們將傳統細胞培養中的氧氣通量與開發的培養室模塊中的氧氣流量進行了比較。。計算表明，在常規96孔板中，通過PMP膜的氧氣通量分別是通過100μL和200μL介質的10倍和20倍。100–200μL是96孔板中使用的標準體積范圍。這意味著，當在2D標準培養基體積的常規孔板中培養時，任何具有足夠氧氣供應的細胞系在開發的培養室模塊中類似培養時，都應該有足夠的氧氣供應。

4.結論

在這項工作中，我們評估了PMP材料的各種性能，并表明該材料非常適合長期細胞培養和OoC設備。最重要的是，我們已經證明，在A549細胞培養4天的密封培養室中，PMP在供氧方面與PDMS具有相當的性能。對于這兩種材料，氧濃度穩定在16%，而玻璃的氧濃度降低到3%。分析表明，在96孔板中，通過PMP薄膜的理論氧氣通量比通過100和200μL介質的通量高10倍和20倍。因此，在標準條件下培養的任何2D細胞系在所提供的培養室模塊中都應該有足夠的氧氣供應。通過裝置材料本身的充足氣體供應能夠使氧氣供應與培養基灌注脫鉤，從而降低灌注速率并減少細胞上的剪切應力。這最終允許更好地控制OoC設備中的細胞微環境。

我們還發現，A549細胞在PMP膜和涂有聚-L-賴氨酸的玻璃蓋玻片上的細胞粘附、增殖、形態和存活率相似。我們首次展示了在PMP上生長的細胞的透射光圖像，證明了PMP的光學特性適用于非熒光活細胞成像。與PDMS相反，PMP由于其良好的光學性能和剛度，即使對于薄至0.125μm的薄膜，也非常適合高分辨率共聚焦顯微鏡。此外，我們發現PMP與物理和化學設備滅菌（蒸汽滅菌、等離子體處理、紫外線、乙醇、甲醇和Aerodesin 2000）、細胞固定（甲醛）和滲透以及熒光染色兼容。

總之，PMP對于用于長期細胞培養的微流體裝置具有許多優點。隨著器件原型的進一步發展，我們相信PMP將在未來幾年在該領域發揮重要作用。

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