最近，外泌體因其在疾病發展中發揮的重要作用而被公認為重要的疾病生物標志物。然而，從復雜體液中高效分離和富集外泌體繼續阻礙著外泌體臨床應用的研究和應用。在這項工作中，我們開發了一種基于雙切向流過濾的微流控裝置，用于從細胞上清液和人血清中分離外泌體。微流控裝置包含兩個模塊。每個模塊包括兩個聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 板，具有對稱的蛇形通道和一個孔徑為 200 nm 或 30 nm 的納米多孔膜，用于分離較大的囊泡、外泌體和游離生物分子。對稱蛇形通道中的雙切向流過濾設計大大增加了濾液與納米多孔膜的接觸面積，從而提高了分離效率，防止了膜的堵塞。與超速離心（UC）標準分離方法相比，基于微流控芯片的外泌體分離（Chip）具有儀器成本更低、耗材成本更低、時間更短（<120 min）、純度更高（82.8%）、回收率顯著提高（77.8%）等優點。此外，由于無標記分離，微流控裝置收集的外泌體可直接用于蛋白質組學分析等下游分析。該芯片從臨床不同疾病患者血清中分離出的外泌體的蛋白質組學分析結果顯示，與UC分離的外泌體相比，該芯片具有更豐富的疾病相關信息，證明了該芯片在未來臨床上具有良好的實用性。

細胞外囊泡是具有磷脂雙層結構的囊泡，幾乎可以由所有類型的細胞分泌，根據其大小和形成途徑，大致可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體三類。在這些囊泡中，外泌體具有狹窄的尺寸分布，直徑范圍為 40 至 200 nm。外泌體廣泛存在于生物體液中，參與各種生理和病理過程，在細胞間通訊過程中發揮重要作用。腫瘤來源的外泌體是腫瘤發生和轉移的有效介質，攜帶有關腫瘤細胞的特定分子信息，如蛋白質、核酸、脂質體和細胞內代謝物。此外，越來越多的研究采用外泌體作為載藥載體來治療疾病，因為它們具有良好的生物相容性和較高的治療效率。因此，外泌體在臨床診斷和疾病治療中都是很有前途的工具。解決一些基本的技術問題，如外泌體的分離、富集、分子表征和工程化，是這些應用中的重要任務。

然而，生物體液的組成通常非常復雜。例如，多種蛋白質、核酸、囊泡和代謝物共存于人血清中。因此，從人血清中準確提取外泌體是一個巨大的挑戰。基于外泌體的密度、形狀、大小和特異性表面蛋白表達，已經發展出許多分離方法，如基于密度的分離技術、基于大小的分離技術、基于免疫親和捕獲的技術、外泌體沉淀和基于微流控的分離技術。其中，無標記分離方法是近年來外泌體分離的趨勢，避免了標記劑的引入，減少了潛在的污染物，對外泌體的下游分子表征或工程化具有重要意義。到目前為止，超速離心一直是無標記外泌體分離的金標準。然而，由于其回收率低、純度低、操作繁瑣且需要昂貴的設備，難以滿足臨床需求。尺寸排阻色譜（SEC）是另一種以高產量和高純度快速分離外泌體的寶貴技術。然而，應使用大量的緩沖溶液從分離柱中洗脫外泌體，這導致收集的外泌體濃度相對較低。如果需要下游分析，可能需要在UC的幫助下富集外泌體。近年來，微流控技術顯著推進了納米級顆粒的無標記分離。到目前為止，已經開發了許多用于分離外泌體的微流控平臺，例如基于粘彈性、聲學、慣性、電和離心力的微流控平臺。使用微流控技術進行外泌體分離仍存在一些緊迫的問題，如器件制造的復雜性、成本仍然很高、需要特殊設備等。最近，基于膜過濾的微流控裝置被開發出來，通過納米多孔膜的尺寸篩分，將外泌體與體液中的其他成分直接分離。這些設備相對容易制造，制造和運營成本低。更重要的是，外泌體分離效率相對較高，產率較高，操作時間短，具有巨大的臨床應用潛力。然而，大多數基于膜過濾的微流控裝置在外泌體分離中使用垂直過濾，導致系統中壓力過大并容易堵塞。最近，Qiao等人設計了一種基于切向流過濾的微流控芯片，用于從人血漿中分離外泌體[26]。切向流設計避免了垂直過濾壓力大、易堵塞等問題，蛇形通道設計允許液體與濾膜接觸面積更大。然而，在注入微流控裝置進行外泌體分離之前，仍應使用高速離心對血漿樣品進行預處理。該裝置只能用于從蛋白質污染物中分離外泌體，這嚴重限制了該裝置的廣泛應用。

腫瘤來源的外泌體攜帶來自母體細胞的豐富信息，包括四跨膜蛋白、細胞信號分子、致癌蛋白、伴侶蛋白、細胞骨架、遺傳物質、蛋白酶和抑癌基因。對于癌癥患者來說，腫瘤細胞分泌的外泌體將攜帶豐富的疾病相關信息。腫瘤細胞與腫瘤分泌的外泌體之間的相關性將成為癌癥診斷和后續治療的重要基石。蛋白質是疾病發展中的主要功能分子。因此，更好地了解外泌體中的蛋白質組成對于癌癥的評估至關重要。蛋白質組學是揭示蛋白質組成、結構和活性的有用方法。使用蛋白質組學分析外泌體蛋白有望大大加深我們對外泌體和疾病的理解。

在此，我們設計了一種基于雙切向流過濾的微流控裝置，用于外泌體分離和富集。使用孔徑為 200 nm 和 30 nm 的多孔膜分選出 30 至 200 nm 之間的囊泡，可以分離和純化來自常規外泌體溶液（細胞培養上清液和人血清）的外泌體。比較了本方法與UC方法的回收率、純度、設備和耗材成本以及操作時間。此外，通過蛋白質組學對兩種方法分離的肝臟相關疾病患者血清中的外泌體進行分析和比較，實現了對不同疾病類型的區分和可能的治療靶點的篩選。

免責聲明：論文來源https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.341160  以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。 轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除。