摘要

迫切需要能夠分解聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）等合成塑料的酶。盡管如此，由于缺乏檢測和分類具有巨大多樣性和豐度的環(huán)境微生物的技術(shù)，瓶頸仍然存在。在這里，我們開發(fā)了一種熒光激活液滴分選 （FADS） 管道，用于高通量篩選 PET 降解微生物或酶 （PETases）。該流程包括三個步驟：封裝單細(xì)胞的液滴的產(chǎn)生和孵育，皮秒注射二苯甲酸熒光素（FDBz）作為熒光探針，以及篩選液滴以獲得PET降解細(xì)胞。我們表征了與該方法相關(guān)的關(guān)鍵因素，包括區(qū)分PETase與其他酶的特異性和敏感性。然后，我們優(yōu)化了其性能以及與環(huán)境樣品的兼容性。該系統(tǒng)用于篩選PET紡織廠的廢水樣品。我們成功地從九個不同的屬中獲得了PET降解物種。此外，來自分離株內(nèi)生Kineococcus Un-5和表皮葡萄球菌Un-C2-8的兩種假定的PETase被遺傳衍生，異源表達(dá)，并初步驗(yàn)證了PET降解活性。我們推測，F(xiàn)ADS管道可以被廣泛用于在各種環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新的塑料降解微生物和酶，并可用于使用合成生物學(xué)的降解酶的定向進(jìn)化。

PET降解微生物的單細(xì)胞篩選

介紹

合成塑料已成為現(xiàn)代生活中不可或缺的一部分。塑料污染問題正在加劇，尤其是在 COVID-19（2019 年冠狀病毒病）大流行爆發(fā)之后。由于其優(yōu)異的化學(xué)耐久性和熱性能，聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）已成為制造瓶子和纖維的主要熱塑性樹脂。PET廢物的控制、回收和處理是一個巨大的挑戰(zhàn)。因此，人們非常關(guān)注微生物對PET的生物降解，以解決PET廢物引起的問題。只有少數(shù)微生物PET降解酶（PETases）被報道，包括來自Thermobifida的角質(zhì)酶樣酶和來自南極念珠菌的脂肪酶或酯酶和脂肪分解耶羅菌。已發(fā)現(xiàn)源自Ideonella sakaiensis的PETase將PET降解為對苯二甲酸單（2-羥乙基）酯（MHET）和對苯二甲酸（TPA）。DuraPETase、EXO-PETase和葉枝堆肥角質(zhì)酶 （LCC）最近通過基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程開發(fā)，以提高催化活性和熱穩(wěn)定性。盡管取得了所有這些突破，但人們可以預(yù)期，基于自然界中微生物的巨大遺傳多樣性和豐度，尚未發(fā)現(xiàn)更多的微生物PETase。然而，從環(huán)境中發(fā)現(xiàn)新的PETases既費(fèi)時又費(fèi)力。它涉及富集、篩選、培養(yǎng)、酶表達(dá)和活性驗(yàn)證。由于當(dāng)前分選技術(shù)效率低下，新型降解微生物和酶的篩選仍然是一個緩慢而復(fù)雜的過程。塑料生物降解的傳統(tǒng)測量包括塑料失重、機(jī)械性能或化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化以及二氧化碳排放，但這些可能需要長達(dá)幾個月的時間。已經(jīng)開發(fā)了用于PET薄膜水解的高效液相色譜（HPLC）或吸光度測定，但尚未擴(kuò)大到環(huán)境微生物群落或大規(guī)模突變文庫的高通量分析。先前的一項(xiàng)研究使用4-氨基安替比林（4-AAP）在酶板篩選中模擬PET聚合物。然而，由于缺乏快速、特異性、靈敏和定量的檢測和分選方法，仍然難以有效地評估PETases的活性。

為了克服篩選功能微生物或酶的瓶頸，已經(jīng)開發(fā)了各種高通量篩選技術(shù)。其中，引入微流控?zé)晒饧せ钜旱畏诌x（FADS）可顯著簡化操作，提高分選效率和靈活性，并降低大型文庫篩選的成本。FADS 技術(shù)正在迅速發(fā)展和適應(yīng)，以滿足不同微生物的分類。引入同心分選通道設(shè)計(jì)以施加延長的介電泳力，從而在分選過程中實(shí)現(xiàn)較大的撓度并提高可靠性;順序電極陣列旨在允許以更高的通量分選大液滴。FADS已成功應(yīng)用于篩選脂肪酶/酯酶，DNA/XNA聚合酶，纖維素酶和NAD（P）依賴性氧化還原酶通過結(jié)合高靈敏度和特異性的熒光酶測定。在此，我們開發(fā)了一種基于 FADS 的方法，用于加快 PETase 的搜索，然后通過基準(zhǔn) PETase 驗(yàn)證其性能。我們用它來從PET紡織廠的廢水中獲得PET降解微生物，并評估了用于PET降解活性的假定新PETase。我們設(shè)想，本研究中開發(fā)的FADS管線可以廣泛應(yīng)用于PET降解微生物和酶的發(fā)現(xiàn)。

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