細胞捕獲分離是免疫學、診斷檢測、病理研究等學科經常用到的生物學實驗方法．近年來，微流控芯片平臺的細胞捕獲分離方式花樣繁多，層出不窮，它具有可快速檢測、所需樣本量少、節約試劑、成本低廉等優勢。微流控細胞捕獲分離的方法，以免疫捕獲分離和無標簽細胞分離兩類對其進行介紹．免疫捕獲分離是較為傳統的細胞捕獲分離方式，它的特異性好、捕獲分離后的細胞純度較高．無標簽細胞分離是近幾年熱門發展的技術手段，它采用物理學與生物學相結合的方式，能較好地保持細胞的完整性和生物活性。

細胞捕獲分離是指把在液體中的多種混合細胞通過物理學、化學、生物學等手段，從液體中分離出一種或幾種細胞的過程．細胞捕獲分離作為生物學、醫療診斷、毒理監測等方面的重要實驗內容，一直是實驗室研究的一個熱點．細胞捕獲分離后可用于細胞計數、細胞培養、細胞免疫及細胞周期狀態觀測等后續實驗，是一種必不可少的實驗手段．

細胞計數與細胞捕獲分離的區分并不明確，細胞計數常會用到細胞捕獲分離作為前置手段，但很多細胞計數的手段和方法并不能適用于細胞捕獲分離．細胞計數只要求得到規定樣品中目的細胞數，可以通過破壞細胞結構[1]或在混合樣品中直接針對特定細胞的電容、電阻進行測定[2]，并不一定要對目的細胞進行捕獲分離．而細胞分離則需要從樣本中有針對性地分離出所需細胞，往往對收集后的細胞還有較高的要求，需要保持細胞原有的形態，甚至一些實驗還要求細胞生長狀態正常，以便對其進一步地觀察和研究．這就大大限制了細胞分離的方法，提高了難度．

細胞計數主要包括白細胞、紅細胞、循環腫瘤細胞等細胞計數．白細胞計數(包括CD3+/CD4+/CD8+T淋巴細胞計數等[3])常用于檢測炎癥反應、人體免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)感染[4]、寄生蟲感染等與人體免疫相關的疾病[5]，其數值的升高和降低都會對體內免疫系統產生巨大影響，常作為人體健康狀況的重要參照指標．紅細胞計數作為血常規的一個檢測指標，常用于貧血、白血病等病癥的檢測．另外，近年來針對癌癥相關研究的不斷突破，計數檢測外周血中痕量循環腫瘤細胞(circulatingtumorcells，CTCs)也成為了癌癥診斷的一個生物標志物，可以檢測癌細胞的遷移[6]．除細胞計數外，生物科學和醫療診斷的前期實驗也常需要細胞分離技術，為后續如藥物刺激、細胞培養等實驗研究做準備．

目前細胞分離的手段多種多樣，如流式細胞分離、蔗糖密度梯度離心細胞分離、介電電泳分離[7]等。

微流控芯片技術是指把生物學、化學等實驗的基本操作過程集成到一塊芯片上，其芯片內部結構中至少有一維為微米甚至納米尺度規格結構，可以自動完成實驗及分析的全過程．由于微流控芯片具有集成性、高通量、檢測快速、操作便利、所需樣本量少、低耗能、低成本等優點，近年來其在藥物篩選、環境檢測、司法檢測、臨床診斷和生物醫藥研究等眾多科研與生活領域擁有越來越廣闊的應用前景[2]．

微流控芯片主要是在微米尺度下操控的流通技術，但是與傳統的流通技術相比，微流控系統一個最重要特征就是微型化，而且同時要考慮便于攜帶和檢測，微流控芯片在精細結構上要比流體技術更為復雜．微流控芯片的主要構成部分根據不同的實驗目的與需求會有很大的不同，有關細胞捕獲分離的微流控芯片，大多包括進樣管路、細胞捕獲或分離區域、廢液收集區和反應檢測區幾部分(圖1)．進樣管路和廢液收集區域屬于基本構造，大部分微流控芯片的構造也基本相近，并非是影響實驗和微流控芯片的關鍵部分．而微流控芯片主要的功能區在于捕獲分離區和反應檢測區，這兩部分也是不同微流控芯片的關鍵和特色區域．在捕獲分離區主要是根據細胞的大小形態等物理特性對目的細胞進行分離攔截或特異性結合捕獲目的細胞．在反應檢測區域，應用光學傳感器是一類較為廣泛的檢測方法，此外還有表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，SPR)、波導管、熒光、單細胞表征分析和化學發光等檢測方法[8]．

圖1微流控芯片結構示意圖

微流控芯片細胞捕獲分離主要方法

常見的微流控芯片細胞捕獲分離方法有磁珠捕獲分離[9-10]、微矩陣捕獲、微液滴分選[11-12]、聲波分離等方法，按最終捕獲分離細胞的狀態可分為免疫捕獲細胞分離和無標簽細胞分離兩種(表1)．

免疫捕獲細胞分離的方法目前在生物學領域應用較廣，該類方法主要根據抗體可以特異性結合目的細胞表面抗原，借此分離目的細胞．其優點在于可以特異性地捕獲目的細胞，所得到的細胞純度較高，也是目前普遍使用的細胞捕獲、計數方法．其缺點在于捕獲分離后的細胞表面多帶有捕獲抗體甚至其他標記熒光、微珠等，不利于后續細胞的培養和狀態性質的進一步觀察研究，多用于細胞計數等檢測手段．

抗體特異性細胞捕獲是生物學上最常用到的捕獲方法，通過細胞表面的抗原與特異性抗體結合，固定抗體以捕獲細胞．對于抗體特異性捕獲細胞，抗體相對于捕獲細胞靶點的親和性是十分重要的．但是由于一個完整細胞要比抗原、抗體大很多，用一個或幾個抗原-抗體相結合很難抓住一個細胞，所以在抗體特異性細胞捕獲中，往往需要控制流速、采用多個結合點多次攔截捕獲細胞的方法[13-14]，加大細胞被捕獲的幾率(圖2a)．

磁珠細胞分離：磁珠標記抗體特異性結合目的細胞，再通過磁力分離目的細胞，是實驗中經常會用到的方法．磁珠捕獲細胞分離的方法應用范圍廣泛，只要有可以與目的細胞特異性結合的抗體就可以有針對性地捕獲細胞．而且大多數情況下，磁珠捕獲細胞的特異性很高，但是磁珠的大小、抗體對細胞表面抗原的親和性強弱以及細胞所在緩沖液的黏稠度等因素對于目的細胞捕獲效率影響很大，尤其在細胞環境較復雜(如全血條件)時磁珠的捕獲效率較低．

表面張力不相容過濾篩選/非混相屏障細胞篩選：表面張力不相容過濾篩選(immisciblefiltrationassistedbysurfacetension，IFAST)是通過微尺寸物理現象建立的不相容液體流向壁壘(非混相屏障)[18]，不相容液相界面間具有較高的能量，形成一道屏障，可以阻止不想要的細胞或其他雜質通過．Scott及其實驗室利用IFAST方法從混合型的基質細胞、熒光、全血中特異性分離乳腺癌細胞，效率大約為70%，純度＞80%，還可以通過多級非混相屏障提高分離純度．該方法符合微流控芯片操作特點，成本低廉、操作簡便、反應快速，而且不需要洗去多余成分步驟，降低了洗滌步驟帶來的不確定性，但利用IFAST方法分離，在進樣腔內需要事先用磁珠捕獲目的細胞，再利用磁鐵把目的細胞從非混相腔吸出到收集腔(圖2c)，細胞結合磁珠可能對細胞的后續操作會有影響，如果可以尋找方法從非混相腔中直接獲得目的細胞，利用范圍會更廣．

圖2免疫捕獲細胞分離芯片結構示意圖(a)抗體特異性細胞捕獲示意圖．(b)磁珠細胞分離芯片示意圖．(c)表面張力不相容過濾篩選芯片示意圖．

無標簽細胞分離大多采用物理學中流體力學、慣性力等方法[19-20]，根據細胞自身物理形態或利用黏附分子等對細胞表面施加瞬間作用力，使不同細胞在微流控通道所受外力不同，從而達到細胞分離的目的．無標簽細胞分離方法優勢在于分離出的細胞表面無任何其他修飾，可以繼續培養及觀察細胞理化性質．但無標簽細胞分離由于是通過物理分離法，得到目的細胞常常純度不高，其中混雜有其他雜質或非目的細胞．

小孔徑攔截細胞分離：由于不同細胞在大小、形態、剛性、透光度等方面都會有所差別，借由物理方法可以對細胞進行分離．目前所用物理方法分離細胞的手段也越來越多樣化，最基本的是根據細胞大小和外形差異，直接進行分離．

非對稱流系統細胞分離：非對稱流分離系統(asymmetricalflowfield-flowfractionation，AFF)是通過不對稱分子模式的瞬間作用力，在物理方面廣泛運用的側向位移，同時延長了分子特異性標簽的長度，可以有效地從全血的持續液流中分離出白細胞．相對于垂直作用力的細胞連續分離方式(如電泳法、聲波法、引力作用、慣性作用、外磁場力等)，非對稱流分離系統通過黏附分子對細胞施加瞬間不對稱作用力，偏轉流動過程中細胞的垂直方向作用力，不需要捕獲而達到細胞分離效果．這種微流控芯片的滾動附著力是通過在微流控通道中修飾一層黏附分子P選擇素，施力作用于淋巴細胞表達的P選擇素糖蛋白配體1(P-selectinglycoproteinligand-1，PSGL-1)，使淋巴細胞滾動方向發生偏移(圖3b)[24]．這種微流控芯片可以分離復雜環境中的目的細胞，細胞不需要標記標簽，避免不可逆的細胞捕獲，分離后細胞有較高的存活率及功能完整性。

聲波細胞分離是在芯片微通道兩側，通過聲波對細胞施加外力，由于細胞的大小、質量、密度等物理性質不同，所受聲波力不同，使細胞在微通道中偏轉角度改變，不同種細胞會流成幾股液流，在不同方向收集，以達到細胞分離目的．為了區分一些物理狀態相似細胞，也可以特異性標記一些微珠在目的細胞表面，以此改變細胞的物理特性，而更好地分離出目的細胞．

微液滴細胞分離/熒光激活細胞分選：流式細胞術是細胞計數、分選及性質分析中常用到的手段，微液滴細胞分離所用原理與其類似，但簡化了流式細胞儀的復雜構造．微液滴細胞分選整合了熒光激活細胞分選(fluorescence-activatedcellsorting，FACS)[30]和微液滴芯片技術[31]，從單向微流控芯片技術改為T型結構或流動匯聚型結構，樣品被鞘液包裹形成小液滴，目的細胞標識熒光染料后通過檢測器[32]，激光激活染料熒光再利用光信號收集所要的目的細胞．微液滴細胞分離的精確度和純度都較其他微流控芯片方法更好，但芯片所需配套設備復雜，而且并不適合如全血等復雜環境下的細胞分離．

多路復用螺旋微流控芯片細胞分離：螺旋微流控芯片分離細胞是利用曲線微通道中迪恩旋渦流動力原理，較大的CTCs在通道中的慣性上升力與內壁作用力相抵消在螺旋通道內壁流動，而血液中其他較小的物質則靠近外壁一側流動(圖3e)，可以借此利用迪恩渦心力實現CTCs從全血中的分離。

圖3無標簽細胞分離方法芯片結構示意圖(a)小孔徑攔截酯膜電鏡圖．(b)非對稱流系統細胞分離示意圖．(c)斜角表面聲波技術細胞分離．(d)微液滴細胞分選．(e)多路復用螺旋微流控芯片細胞分離示意圖．

細胞捕獲分離一直是免疫學、診斷檢測、病理研究等學科經常用到的生物學實驗方法．微流控芯片的主要優勢在于：a．上樣體積小，節約原料、試劑與樣本；b．檢測結果單個周期短，可以實現快速測量，節約時間；c．適用于高通量檢測或宏觀尺度無法實現的實驗操作，具有低成本、高效快速的特點，在細胞分離過程中更易做到微觀操控、精準分析．

在微流控芯片中，通過抗體捕獲、熒光標記等標簽標記目的細胞后，多數情況下會對細胞本身產生一定的影響，大多只能用于捕獲分離后的細胞計數．無標簽細胞分離多數是通過物理方法，利用微流控芯片的流體力學原理，從細胞大小、尺寸等方面實現細胞分離．無標簽細胞分離優勢在于分離后的細胞既可用于細胞計數，也可用于細胞理化性質觀察、細胞增殖培養等后續實驗，也是目前細胞分離方法的主要發展方向，但相對于標簽捕獲分離的方法，在純度和特異性上還需要提高．今后微流控芯片在細胞捕獲方面可能更傾向于非標簽方式的捕獲分離，結合物理學與生物學的方法，根據所做實驗的需要，在捕獲效率與純度方面更好協調，高效方便快捷地實現細胞分離的目的．

用于細胞捕獲分離的微流控芯片需根據實驗要求選擇合適材料，如果要進一步培養觀察分離出的細胞，還要確定細胞所在芯片環境是否無菌無毒，是否利于細胞存活生長．微流控芯片材料一般有聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)、聚苯乙烯(polystyrene，PS)、玻璃、硅片等．
其中PDMS應用最為廣泛，尤其在細胞捕獲分離實驗中，PDMS具有較好的生物相容性和一定的透氣性，更有利于實驗中細胞的生長存活及性質分析，但芯片微結構易變形，所以較難應用于商業化大批量生產，而更適用于科研過程中芯片結構及實驗效果摸索．PMMA隨著材料及切割技術的發展越來越普及，在微流控芯片的實驗室發展過程中逐漸得到了廣泛應用．相信隨著微流控芯片技術和材料科學的不斷進步，更多適用于實驗要求的材料也會不斷為芯片的制作及商業化生產提供強有力的推動，促進微流控芯片技術更快更好地發展。

微流控芯片目前的發展策略主要有兩個方向：一類是利用微流控芯片高通量、上樣量小等優勢，在科研過程中使用，解決一些在宏觀層面不易達成的實驗問題，這類芯片并不一定要求最終結果直接在芯片中顯示出來，而是作為一個高精密度的反應容器，最后可利用實驗室內的其他儀器配合實驗，分析結果．另一類是以商品形式面向普通群眾為主要目的芯片，這類芯片往往需要有高度整合性，同時配備微型化的檢測及數據處理裝置，具有可手持診斷、價格適中、方便操作等優點，使用者只需做簡單加樣就可由儀器經過暗箱處理后直接得到最終結果，體現了微流控芯片小型、簡便、快速測定的優勢．微流控芯片在細胞捕獲分離方面，目前主要集中于實驗室層面，配合其他儀器使用，而后一類高度集成的微流控芯片還相對較少，且實現難度遠高于前一種形式．但相信隨著微流控技術和構造方法的進一步發展，細胞捕獲分離技術的持續創新，基于微流控芯片的細胞捕獲、分離將在科學研究和臨床診斷中逐漸得到廣泛應用，為提升人類健康水平做出貢獻．

免責聲明：文章來源《生物化學與生物物理進展》DOI: 10.16476/j.pibb.2016.0147 作者：董盛華 張晶 葛勝祥   以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。 轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除。