3  表面等離子體共振技術(shù)

3.1  表面等離子體共振技術(shù)的發(fā)展

表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）是指當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍在玻璃表面的薄層金屬膜上發(fā)生全反射時，若入射光的波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率一致， 光線即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振，即表面等離子共振。由于共振的產(chǎn)生，會使反射光的強(qiáng)度在某 一特定的角度大大減弱，反射光消失的角度稱為共振角。共振角的大小隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合物的分子質(zhì)量成正比。由此，在20 世紀(jì)90 年代發(fā)展了應(yīng)用 SPR 原理檢測生物傳感芯片( Biosensor chip) 上的配體與分析物作用的新技術(shù)。在該技術(shù)中，待測生物分子被固定在生物傳感芯片上，另一種被測分子的溶液流過表面，若二者發(fā)生相互作用，會使芯片表面的折射率發(fā)生變化，從而導(dǎo)致共振角的改變。而通過檢測該共振角的變化，可實時監(jiān)測分子間 相互作用的動力學(xué)信息。雖然SPＲ篩選通量不及HTS和HCS，但其不需任何標(biāo)記，能在更接近生理溶液的環(huán)境中直接研究靶標(biāo)和分析物的相互作用，使之在藥物研究中占據(jù)著重要的一席之地。隨著商品 化SPＲ生物傳感器儀器技術(shù)的逐步成熟，儀器的管路系統(tǒng)、進(jìn)樣方式及檢測速度等也發(fā)生了巨大變化，從最初的單點單通道分析到多通道陣列式分析，在分析通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面有了很大改進(jìn)。 近年來在藥物篩選領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。圖2 展示了不同時期SPＲ芯片的通路變化，其中A為一對 一模式，每個位點相互獨立，任何一個樣品只能流過其中某一個通道，通道間不能互為對照。B 是Biacore 3000 型芯片格式，4 個位點用管路相連，任何一個位點可以為其它3 個位點做空白背景的對照；C是Biacore T100 型芯片格式，1-2 通道和3-4 通道直接相連，使相鄰的兩個位點間距離明顯縮短， 對照效果更好，基線更平穩(wěn)；D是Biacore S51 的芯片格式，可以同時分別進(jìn)4 個樣品，任一通道均可 作為對照通道。G被襯為一次動力學(xué)模式芯片，是 Bio-Rad ProteOn XPR36 的芯片格式，可以一次性 平行標(biāo)記6 個配體，芯片再旋轉(zhuǎn)90°，在垂直方向平行流過6 個分析物或者6 個不同濃度梯度的同一分 析物，一次進(jìn)樣可完成兩個分子間的動力學(xué)監(jiān)測。

圖2  各種SPＲ傳感器的芯片格式

3.2  SPＲ技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

隨著SPＲ技術(shù)檢測靈敏度的提高，SPＲ的檢測對象不再局限于大分子之間的相互作用，也可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)－小分子、核酸－小分子之間相互作用的檢測。由于SPＲ技術(shù)能夠直接反映兩個分子間相互 作用的強(qiáng)弱和動力學(xué)模式，所以采用SPＲ方法可對蛋白化合物庫、小分子化合物庫等進(jìn)行篩選，假陽性率大大降低。Geschwindner等采用 SPＲ 篩選以蛋白片段為靶標(biāo)的小分子活性化合物，比傳統(tǒng)檢測方法得到更多的活性物質(zhì)，且SPＲ方法的Z－factor( 為0.67) 遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測方法( 為0.37) ， 說明SPＲ篩選方法所得結(jié)果更穩(wěn)定可靠。G 蛋白偶聯(lián)受體( GPCＲs) 是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì)， 其拓?fù)錁?gòu)象為7 次跨膜的受體，同源性較低，當(dāng)膜外的配體作用于該受體時，該受體的膜內(nèi)部分與 G 蛋白相互結(jié)合，激活G蛋白。大多數(shù)的細(xì)胞激素和神經(jīng)遞質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外的交流通過GPCＲ信號通路完成， 藥物作用于GPCＲs從而達(dá)到治療目的。迄今已發(fā)現(xiàn)作為治療藥物靶點的蛋白總數(shù)約500 個，而GPCＲs 靶點占其中受體的絕大多數(shù)。很多科研工作者先后進(jìn)行了用 SPＲ 技術(shù)篩選 GPCＲ 配體及藥物的研 究。本課題組利用ProteOn XPＲ36 儀器，建立了分別以 DNA、ＲNA 和 POT1 蛋白、Aβ 蛋白等為 靶標(biāo)的小分子藥物篩選模型，可對源源不斷新合成的化合物進(jìn)行初步的活性篩選，為化合物的進(jìn)一步 開發(fā)研究提供了非常有參考價值的實驗數(shù)據(jù)。

4  微流控芯片技術(shù)

4.1  微流控芯片技術(shù)的發(fā)展

在毛細(xì)管電泳發(fā)展的基礎(chǔ)上，20 世紀(jì)90 年代Manz等提出了微全分析系統(tǒng)，即微流控芯片( Microfluidic chip) 或芯片實驗室( Lab on a chip) ，它是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、 分離、檢測及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小) 的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實驗室的各種功能 的一種技術(shù)平臺。經(jīng)過幾十年的飛速發(fā)展，微流控芯片系統(tǒng)的芯片制作、檢測器研制、加樣操作等 相關(guān)技術(shù)已日趨成熟并規(guī)模化，其應(yīng)用范圍覆蓋了醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域，在藥物篩選方面也得到了非常廣泛的應(yīng)用。并憑借其樣品及試劑消耗少、分析速度快、效率高、操作模式靈活多變，以及可在生理環(huán)境或接近生理環(huán)境下運行等優(yōu)點，為大規(guī)模高通量藥物篩選提供了 絕佳的實驗和檢測技術(shù)平臺。微流控芯片是最有可能滿足高通量篩選要求的新興技術(shù)平臺之一。

4.2  微流控芯片技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

在微流控芯片上進(jìn)行藥物篩選，可大致分為分子水平、細(xì)胞水平和整體動物水平3 大方面的藥物 篩選。在分子水平的藥物篩選中，美國 Caliper Life Sciences 公司將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于藥物篩選領(lǐng)域，開發(fā)了微流控芯片實時動力學(xué)檢測功能的 EZ Ｒeader 系列藥物篩選平臺，在不加中止試劑的情況 下檢測酶學(xué)實驗。用于實驗的底物是帶有熒光標(biāo)記的多肽，底物在反應(yīng)體系中酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其所帶的電荷也發(fā)生相應(yīng)的變化，利用底物和產(chǎn)物所帶電荷的不同，將二者在芯片通道中進(jìn)行分離，并分別檢測。在檢測過程中，96 或384 孔板中的反應(yīng)物通過芯片底部的吸樣針被吸入芯片通道。由于 在芯片的分離通道上施加了分離電壓，帶有熒光標(biāo)記的多肽底物和反應(yīng)產(chǎn)物由于電荷的不同而被分離， 然后在檢測窗口進(jìn)行檢測( 見圖3) 。在檢測每一個樣品時，可以同時看到底物和產(chǎn)物的信號。該系統(tǒng)可用于大規(guī)模的激酶抑制劑篩選。本課題組已在 EZ Ｒeader 平臺上開展激酶抑制劑的篩選研究。在細(xì)胞水平的藥物篩選上，微流控芯片也具有獨特優(yōu)勢。它可以將細(xì)胞種植、培養(yǎng)、標(biāo)記、刺激、加藥、梯度稀釋等操作通過微通道網(wǎng)絡(luò)流體控制技術(shù)集成到一張芯片上完成，保持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，可全面記錄細(xì)胞對藥物刺激的各種反應(yīng)。Ye 等構(gòu)建了一套用于細(xì)胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統(tǒng)，芯片結(jié)構(gòu)的主體部分是由8 個 金字塔形的濃度梯度生成器網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圍繞一個公共的廢液池構(gòu)成，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)單次可產(chǎn)生64 種藥物作用條件，并獲得192種細(xì)胞生物信號。為了進(jìn)一步提高藥物篩選的準(zhǔn)確性，在體的藥物篩選越來越受到人們的重視，并且為了降低篩選成本，會優(yōu)先使用 一些模式生物來篩選藥物，如秀麗隱桿線蟲、斑馬魚胚胎等。微流控芯片則成為實現(xiàn)整體動物水平藥 物篩選的良好平臺。本課題組在微流控芯片上建立了斑馬魚癲癇模型，研究了維生素C和苯 妥英鈉對斑馬魚幼魚癲癇的解救作用。此外，《分析測試學(xué)報》近期策劃的專題——— 《微流控技術(shù)在 分析檢測中的應(yīng)用》，對我國微流控技術(shù)在分析檢測領(lǐng)域的最新研究成果進(jìn)行了總結(jié)與集中報道，其中 也凸顯了微流控技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用優(yōu)勢。

圖 3  微流控芯片分離檢測酶產(chǎn)物和底物的示意圖

5  展  望

新藥開發(fā)，有助于治療人類所面臨的各種重大疾病，提高患者的生存質(zhì)量，延長壽命，而藥物篩 選則是發(fā)現(xiàn)新藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。藥物篩選新技術(shù)的應(yīng)用，能更快速有效地從龐大的化合物庫中篩選出有 藥理活性的藥物，提高新藥開發(fā)速度，降低新藥研發(fā)成本。藥物篩選新技術(shù)之間的相互融合匹配將能 更好地達(dá)到藥物篩選的目的。比如HTS技術(shù)可借鑒HCS的成像系統(tǒng)，將檢測對象的反應(yīng)過程通過精密 數(shù)碼相機(jī)記錄下來，為藥物活性評估提供更全面的信息。HCS 的發(fā)展可更加切實地做到高內(nèi)涵篩選，

目前已發(fā)表的有關(guān)HCS論文中，60%～80%的文章只用到雙通道成像檢測細(xì)胞對藥物刺激的變化，離 多通道高內(nèi)涵檢測還有一定距離。經(jīng)過HTS和HCS 篩選的靶標(biāo)和藥物，可以采用 SPＲ 技術(shù)進(jìn)行二次篩選，以進(jìn)一步確證藥物的活性，降低藥物開發(fā)的投資風(fēng)險。微流控芯片技術(shù)由于其微型化集成化的特點，有望集成HTS、HCS以及SPＲ篩選技術(shù)于一體，既能在分子水平評估藥物活性，也能在細(xì)胞水平監(jiān)測藥物對細(xì)胞的影響，從而更加全面完整快速地對藥物進(jìn)行篩選。毫無疑問，隨著科技進(jìn)步及社會發(fā)展的需要，新的藥物篩選技術(shù)會不斷出現(xiàn)，各種新興技術(shù)各自發(fā)展又相互融合是未來藥物篩 選技術(shù)的發(fā)展方向，這將為新藥開發(fā)提供更強(qiáng)有力的技術(shù)支持，從而為人類的健康帶來福音。

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