醫藥產業是事關國家未來經濟社會發展的重要戰略性產業，是世界公認的最具發展前景的國際化高技術產業之一。新藥研發帶來的新技術創新和新品種上市是推動醫藥產業發展的源動力。隨著現代科技的發展，計算機模擬設計、化學合成、生物提取、天然產物提取等領域的技術突飛猛進，使得目標化合物的獲取更加快速高效，并在此基礎上建立了以來源、結構、作用等不同特點進行分類的各種化合物庫，化合物庫的樣品數量從幾百到上百萬不等。如美國 ChemDiv 公司擁有全球最大的小分 子化合物庫，除了目前庫存的125 萬種化合物以外，每年以15 萬種新化合物的速度遞增。我國的化合物樣品庫儲量在2015 年將超過100萬個，具有結構多樣化、存儲專業化、管理集中化、信息系統化和質控標準化等特點。如何從海量的化合物中篩選出有藥理活性的化合物或先導化合物，是目前醫藥行 業的研究熱點之一，也是各科研院所、醫藥公司傾力投資發展的一個重要方向。

藥物篩選是指對可能作為藥物使用的各種物質，包括化學合成的化合物、蛋白多肽、天然產物、 海洋產物等，應用適當的篩選方法和篩選技術，檢測其可能存在的藥理活性，為開發新藥提供實驗依 據的方法，是連接藥物從實驗室研究到臨床應用的重要紐帶，也是提高研發效率、縮短周期、減少成本、降低風險、使新藥研發能夠持續進行的關鍵。藥物篩選的歷史悠久，所采用的技術、方法也在不斷進步，新技術的應用，促進了藥物篩選的發展和進步。應用新的藥物篩選技術也成為醫藥科學研 究的重要內容。本文就近年來新發展的藥物篩選技術并結合現有的藥物篩選技術及其應用進行了簡要綜述，主要包括高通量篩選技術、高內涵篩選技術、表面等離子體共振技術及微流控芯片藥物篩選 技術。

1  高通量篩選技術

1.1  高通量篩選技術的發展

高通量篩選( High throughput screening，HTS) 技術，首先需要配備快速處理樣品的全自動工作站，靈敏快速的檢測儀器和強大的計算機控制系統等硬件設備，以分子水平或細胞水平的實驗方法為基礎， 以微孔板作為實驗工具載體，通過程序控制，同一時間對數以千萬的樣品進行檢測，并以相應的數據 庫系統支持整體運轉的技術體系。HTS技術大多是以光學檢測為基礎而建立的分子水平或細胞水平 的分析檢測方法，包括光吸收檢測、熒光檢測、化學發光檢測等。由于HTS 在創新先導物的發現過程中具有快速、高效、微量等特點，雖然其出現只有幾十年時間，卻已在全世界新藥研究機構、大型醫藥公司的創新藥物發現過程中廣泛應用。HTS 模型以分子水平居多，篩選的靶點包括離子通道、酶和 受體等。HTS通常以單一的篩選模型對大量樣品的活性進行評價，從中發現針對某一靶點具有活性的樣品。靶標庫和化合物庫的建立，不僅為創新藥物的發現提供了機遇，也對 HTS 效率提出了新的要 求，使HTS朝著日篩選規模越來越大，速度越來越快的方向發展。目前已形成了可日篩選10 萬樣次的 超高通量篩選技術( Ultra high throughput screening，uHTS)。

1.2  高通量篩選技術的應用

潘麗等建立了穩定可靠的以轉導與轉錄激活子( STAT3) 為靶標的抗腫瘤HTS模型，應用該模型 對8,248 個潛在的抗癌藥物進行篩選，抑制率在80%以上的有5 種，在500 μmol/L 藥物濃度下，化合物MDC6 的抑制率最高為92%，為后續MDC6 的抗癌研究提供了可靠的前期數據。羅睿等建立以蛋白激酶A為靶點的抗結核藥物HTS模型，利用該模型對4,000個微生物發酵液粗提物樣品進行篩選，最終得到21個抑制蛋白激酶A 活性的陽性樣品，陽性率為0.53%；以恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌為檢定菌，平板紙片法檢測陽性樣品的抗分枝桿菌活性，然后對HTS 篩選的陽性樣品的細胞毒性和酶活抑制特異性進行評價，最終得到8個陽性樣品，其中有4個陽性樣品的酶活抑制特異性、抗菌活性均較好，且細胞毒性較低，證明該篩選模型得到的陽性藥品值得進一步研究。隨著耐藥菌株的出現，抗生素的研發變得更加緊迫。應用HTS技術，能快速從人工合成化合物庫或天然產物化合物中篩選出具有潛在抗菌活性的物質。Duetz等提供的高通量發酵技術能在96 孔板中進行菌種發酵，發酵過程能與自動化的提取和掃描平臺整合。該方法能夠在較短時間內研究多達20 種不同的培養基質對微生物次級代謝產物的影響。平板霉素正是采用這種新篩選方法得到的產物。流感病毒的PA_N 蛋白高度保守，且具有核酸內切酶活性，是抗流感藥物研發的潛在靶點。張國防等采用HTS體系，從372 種化合物中篩選出3 種對流感病毒H5N1 的PA_N蛋白抑制作用較好的化合物。將這3 種化合物分別與 PA _N蛋白進行分子對接模擬，結果顯示它們均可與 PA_N 蛋白活性位點的二價金屬離子和氨基酸殘基相互作用，從而為抗流感病毒藥物的發現提供了先導化合物。Canavaci 等建立了用化學發光方法檢 測β-半乳糖苷酶的HTS模型，以384 孔板為載體，篩選了NIH 化合物庫中的303 224 種化合物，得到4,394 種能對抗美洲錐蟲病的陽性樣品，隨后的毒性檢測顯示，其中有3,005 種化合物的 IC50 ＜10 μmol/L。本課題組將由Tecan公司的全自動工作站及其連續波長多功能酶標儀組成的高通量篩選系統用于自主合成的化合物，包括β2 受體激動劑、PDE4 抑制劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑以及自由基清除劑的大量篩選，得到了具有潛在藥理活性的先導化合物。  

2  高內涵篩選技術

2.1  高內涵篩選技術的發展

細胞生物學研究已成為生命科學研究領域中最為重要的部分，尤其是步入到后基因組時代，科學家不再簡單割裂地研究單個基因或單個蛋白的功能，而是開始從一個功能整體的角度考慮問題。HTS 技術單指標的篩選方法，已經不能滿足藥物發現的需要，而且也不利于對化合物活性的綜合評價。因此，以多指標多靶點為主要特點的高內涵藥物篩選( High content screening，HCS) 技術應運而生。

HCS的儀器一般由白色連續光源、多通道濾光片( 適于常用的熒光染料) 、顯微鏡模塊和高速高分辨率 的CCD照相機進行圖像獲取，同時還可以配備細胞培養和自動加樣模塊進行長時間全自動的實驗分析。基于激光的硬件聚焦系統使得自動對焦在200 ms以內，再結合軟件聚焦，完善了對拍攝對象的快速定位和圖像獲取。除了圖像獲取部分外，圖像采集、圖像分析和數據儲存也是高內涵藥物篩選設備 的主要組成部分。

20 世紀70 年代Talyor等最早提出高內涵概念，此后該課題組一直致力于開發定量研究細胞的新工具，1996 年，Talyor成立了 Cellomics 公司，并于1999 年研發生產了世界第一臺商用 HCS 儀器。

進入21 世紀，單克隆抗體技術、細胞的制備方法、熒光染料的開發、儀器設備的改進以及計算機的發 展，使得HCS技術作為一門生物檢測技術已經日臻完善，應用領域日趨廣泛。

相對于HTS結果單一，HCS是篩選結果多樣化的一種篩選技術手段。HCS 模型主要建立在細胞水平，通過觀察樣品對固定或動態細胞的形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝及信號轉導等多個功能 的作用，涉及的靶點包括細胞的膜受體、胞內成分、細胞器等，從多個角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。HCS 技術克服 了以往細胞研究領域的“串行”研究方法（即細胞周期→細胞毒理→信號轉導→代謝調控等）效率低、速度慢的弱點，在同一實驗中， 可完成各種對于細胞生理現象本質的研究。

這不僅大大提高了研究效率，降低了研究成本，避免了大量的重復勞動，同時獲得了比之前成倍，甚至成百倍的海量數據，為各項研究提供了第一手實踐材料。圖 1 直觀比較了HTS和HCS的共同點和差異性。從實驗載體上看，HCS 與 HTS 無顯著區別，均是在微孔板( Microplate) 上進行，兩者的樣品消耗量一致，實驗操作同樣簡單可行、自動化。

從實驗結果看，HTS 實驗結果單一，通常只獲得每個樣品孔的最終讀數。而 HCS 的實驗結果多樣化，既有樣品孔的最終讀數，還有細胞計數、細胞形態學分析、細胞空間結構分析、細胞成像等多種實驗結果。

圖1  HTS和HCS的共同點和差異性比較

2.2  高內涵篩選技術的應用

Baniecki等將HCS用于尋找抗瘧新藥，認為使用基于圖像的 DAPI 惡性瘧原蟲生長實驗，可以 檢測到單個瘧原蟲；而使用DAPI惡性瘧原蟲生長實驗和［3H］標記的次黃嘌呤實驗，96 孔板上得到 的讀數結果顯示，具有活力的瘧原蟲比例為0.25%。兩種實驗手段的結果比較表明，HCS 的靈敏度及 可靠性顯著提高。Xu等針對一系列與肝毒性直接相關的細胞表面形態變化，建立了一個 HCS 檢測 方案。在檢測300 多種藥物和化合物（其中包括許多可以導致人類罕見的肝毒性藥物）時，使用該檢測 方案，檢出率達50%～60%，假陽性率非常低，僅為0～5%。Moffat 等建立了一種基于 HCS 的方法，來鑒定有絲分裂進程中所必須的基因，并針對5,000 種表達獨特的shＲNA、以1,028 個人類基因作為靶點的慢病毒載體進行篩選，篩選到約100 個( 新型) 增殖相關的候選調控元件。此外，在藥物毒性 篩選方面，采用基于熒光成像的 HCS 進行篩選，能夠從單個細胞水平觀察到細胞內部正在發生的事件，實驗結果比傳統的MTT法的靈敏度更高，信息量更大，結果更可靠，從而降低了后續的藥物開發研究失敗的風險。本實驗室建立了以核轉錄因子NFκB為靶標的NFκB－U2OS細胞質核轉染高內涵篩選模型，通過自動獲取細胞質與細胞核的熒光強度差值，陽性組的差值比陰性組差值大8 倍以上，說明 NFκB 在藥物刺激下入核明顯。96 孔板方法評估因子 Z － factor≥0.5。這一模型適于以NFκB為靶標的高內涵藥物篩選。

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