通過基于液滴的分析評估的抗真菌功效結果的驗證

通過比較基于液滴的分析以及WA和96孔板測定評估的kunshi抗真菌潛力的結果，驗證了平臺抗真菌評估的效率。使用WA測定法的抑制百分比最低。在所有測試濃度下，孵育 4 小時后，通過 96 孔板和液滴測定評估的抑制百分比彼此更接近于 WA（表 2）評估的百分比。在4小時和24小時的時間點，使用液滴測定法計算的抑制百分比介于WA和96孔板測定獲得的值之間，所有藥物濃度≤0.5μgμL-1，而在濃度≥2μgμL-1時，液滴測定中記錄了最高的抑制。在不使用抗真菌劑的情況下，在所有三種測定（水瓊脂，96孔板和液滴測定）中真菌孢子的活力為100%。

在本研究中，我們成功開發了一種基于液滴的微流控平臺，用于對植物病原真菌鏈格孢的單個包封孢子進行抗真菌分析。這項工作依賴于植物病理學和殺菌劑分析方法領域的一系列關鍵新進展，例如：（1）開發了一種用于單孢子封裝的片上方法，（2）演示了一種基于生物相容性液滴的測定，使用互花米孢作為絲狀真菌的模型系統，在液滴中存活長達24小時， （3）使用基于微流體液滴的系統進行抗真菌分析的能力。基于微流控的殺菌劑分析平臺可進行可重復的抗真菌分析。以前，已經專門進行了研究以執行基于液滴的操作，例如細胞封裝，液滴混合，片上孵育，液滴合并和液滴分選。然而，這些液滴操作中的每一個都被證明是單獨的模塊，尚未組裝到集成的抗真菌分析測定中。在這里，通過結合片上孢子活力和液滴中的抗真菌分析測定，我們能夠開發一個基于液滴的平臺，用于對植物病原絲狀真菌 A. alternata 進行殺菌劑分析。

為了驗證抗真菌分析平臺，使用 WA 和 96 孔板測定進行了類似的實驗。對于所有3種測定，在兩個時間點測量互花米草孢子萌發的抑制百分比，即孵育4小時和24小時后，以檢查昆氏抗真菌功效的持久性。在所有測試濃度下，通過液滴測定評估的抑制百分比更接近 96 孔板和 WA 測定（表 2）。Pearson相關性分析進一步證實了這些結果（表3）。皮爾遜相關系數衡量兩個連續變量之間的統計關系或關聯。它被稱為測量感興趣變量之間關聯的最佳方法，因為它基于協方差方法。分析表明，在孵育4小時時，96孔板測定和液滴測定之間存在高度相關性（表3）。微量滴定和微滴測定之間的這種高度相關性可以解釋為PDB飽和的環境，類似于水和營養物質的可用性，與傳統的96孔板高度相似。相關性分析表明，在平臺上獲得的結果與在WA和96孔板24 h獲得的結果沒有顯著差異（P < 0.05）。因此，該平臺可用作進行抗真菌分析的工具，其結果將與傳統的 96 孔板和 WA 檢測獲得的結果相當。在孵育4小時時發現的液滴測定與WA之間的相關性較低，這可以通過以下事實來解釋：WA技術依賴于測試化合物擴散到培養基中，因此與稀釋方法相比，培養基中的濃度不均勻。液滴測定和 96 孔板和 WA 測定之間抑制百分比的總體差異是由于 WA 和 96 孔板方法對孢子的批量分析，這是基于液滴的平臺通過直接可視化微流控芯片中封裝的孢子來解決的問題。此外，微流控芯片具有存儲位置，可以不受分析時間的影響來觀察相同的孢子，與96孔板和WA檢測相比具有優勢。該資產是基于 droplet 的平臺的主要功能之一。最后，在3種不同的孢子萌發試驗中，計算了半最大有效濃度（EC50）的孢子抑制作用。通過液滴和 96 孔板測定評估的范圍為 0.125 至 0.25 μg μL?1，而通過 WA 測定評估的 EC50 范圍為 0.25 至 0.5 μg μL?1，表明這些化合物表現出劑量依賴性抗真菌活性。

已經有相對較少的已發表報告比較了確定對植物病原體的抗真菌功效的方法。據我們所知，殺菌劑評估測定方法尚未取得重大進展。在對涉及孢子萌發的技術的觀察中，Gottlieb45發現接種的有毒物質瓊脂法和試管稀釋法同樣敏感。這些結果與目前的結果一致，其中所有三種測定法測量的抑制百分比彼此接近，并且彼此密切相關，表明基于液滴的分析可以產生同樣靈敏的結果。在另一項研究中，通過兩種方法測試了月桂油、肉桂葉油、丁香油、檸檬草油、芥末油、橙油、鼠尾草油、百里香油和兩種迷迭香油：（1） 補充有 100 和 250 μL L-1 精油的黑麥面包和 （2） 暴露于空氣中 136 和 272 μL L-1 揮發油的真黑麥面包。結果表明，精油的抗真菌效果取決于施用方法。使用不同方法的研究進行比較是困難的，并且強調了在測試活動時需要統一和可靠的程序。

基于液滴的新型分析平臺的結合有助于定制和優化現有體外模型中目前缺少的抗真菌評估技術，為研究真菌孢子的生物學和生理學提供了一個平臺。液滴（直徑100μm）以每小時5.4×103個液滴的通量生產，油壓= 210 mb，孢子懸浮壓力= 200，殺菌劑壓力= 200。通過增加并行通道、多個微流控芯片和增加整體壓力，可以提高平臺的總吞吐量。HT分析可以通過將平臺與芯片和陷阱的自動圖像分析相結合來實現（例如使用自動顯微鏡和圖像分析或高內涵篩選顯微鏡方法）。開發的平臺可以通過優化條件，根據所使用的絲狀真菌，在液滴大小、孵育條件（溫度、光周期、培養基等）方面擴展到其他絲狀真菌。基于液滴的抗真菌分析可以使用標準化方法，因為（a）它主要使用已經達到工業質量水平和生產標準的市售儀器，即光學顯微鏡，流量控制儀器，熱塑性芯片，（b）一些關鍵步驟可以半自動或完全自動化和精細控制，例如流速或體積控制。微流控控制器帶來的自動化有助于確保每個液滴的高重現性（相當于板孔），并減少人為錯誤的影響，（c）它依賴于單個孢子分析而不是批量分析。微流控芯片中單個封裝孢子的直接可視化確保了結果的可靠性和可重復性，從而最大限度地減少了偏倚的結論。這也為驗證對給定殺菌劑的反應的潛在異質性提供了可能性。微流控芯片中的特定存儲位置使得觀察相同的孢子與分析時間無關，與96孔板和WA測定相比具有優勢，（d）結果重復了使用兩種常規方法進行的觀察結果，從而驗證了本系統，并與此類傳統方法相比具有互補優勢， （e） 它包括明場顯微鏡分析，這是所有光學顯微鏡照明技術中最簡單的。平臺的簡單性及其與基本設備（光學復合顯微鏡）的集成有助于將該平臺作為標準分析工具，因此很容易被許多研究人員復制，（f）該系統包括一個市售的微流控芯片，該芯片已經滿足大規模標準，可以用作現成的消耗品。與使用自制芯片（例如PDMS芯片、微銑削等）的其他微流控方法相反，這些方法在制造過程中可能會產生一些變化，而使用通常通過模具注射制造的眾所周知的熱塑性塑料（例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等）的大規模芯片生產通常具有顯著較小的單元和批次之間的差異性， （g） 系統能夠在較低的基礎設施下進行抗真菌分析， 人工和消耗品。單個孢子的封閉允許在液滴內快速跟蹤和觀察，從而減少總體評估時間。該技術可以快速分析抗真菌活性，并可集成到工業殺菌劑篩選過程中，以加快發現新的抗真菌劑。這一優勢將增加采用該技術及其向標準化模型發展的興趣。該技術可用于封裝具有不同孢子大小的不同類型的真菌，甚至是真核或原核細胞，例如細菌或哺乳動物細胞。精確的孢子封裝、HT 液滴的產生和操作以及組合篩選的可能性表明，液滴技術可以用作一系列篩選方法的理想平臺。我們開發了一種液滴技術，該技術不僅可用于任何大規模的抗真菌分析研究，而且還非常適合分析抗真菌劑的作用方式和真菌的耐藥性發展。雖然我們只提供了獲得的鏈格孢菌萌發抑制數據，但該平臺可以進一步擴展，用于分析在細胞機制中起關鍵作用的抗真菌劑的分子機制。更深入地了解抗真菌劑的作用方式將有助于優化其應用，從而有助于它們在食品和飼料生產中的成功使用。通過在液滴產生后立即向芯片填充油，可以最大限度地減少液滴的蒸發和泄漏。使用了表面活性劑（1%），該表面活性劑在限制泄漏方面非常有效，并且可以有效地將親水性和疏水性分子包含在液滴中。t = 0 h （100 μm），t = 4 h （99.97 μm） 和 t = 24 h （99.47 μm） 處的液滴大小。在不同時間點（t = 0，t = 4 h和t = 24 h）計算的液滴大小差異可以忽略不計，這進一步證實了液滴中抗真菌劑的泄漏是微不足道的。然而，根據所使用的生物活性分子（疏水性/親水性），不同的方法可能需要額外的控制來優化液滴的泄漏。總之，我們成功開發了一種多功能且高效的微流控系統，用于封裝真菌的單個孢子，然后對液滴進行抗真菌分析。

微流控PDMS芯片制造和單孢子封裝

通過軟光刻技術創建了微流控芯片。該芯片在AutoCAD 2018軟件下設計（圖5a），并由CAD/Art打印在光掩模上。在硅晶圓上制備SU8-2050負性光刻膠模具，通過紫外線照射和隨后的顯影（SU-8顯影液）。將固化劑添加到PDMS基材至終濃度為10%（w/w），混合，倒入模具上。真空脫氣后，將模具在65°C下孵育5小時。然后剝離PDMS，用活檢打孔。PDMS的結構化面通過將兩個部分暴露于配備Equinox的氧等離子體中，與玻璃顯微鏡載玻片結合。微流控芯片用Aquapel處理，然后用HFE-7500油處理。

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