作為一種將微流控芯片技術與液滴技術相結合的新興技術, 液滴微流控技術具有更高的實驗效率和更精確的操作控制能力. 液滴微流控技術可以實現液滴精確控制, 實現液滴之間的快速混合和反應, 液滴作為反應容器, 可以容納多種物質以及微小顆粒, 在高速流動的微通道中可以實現高通量的分析和檢測. 液滴微流控技術可以應用于生物醫學研究中更復雜的微觀實驗操作和分析, 尤其是在高通量單細胞分析實驗和材料合成等相關應用中承擔重要角色. 單細胞的排列、分離和隔離, 藥物與細胞的共封裝, 是液滴微流控技術應用的關鍵步驟.

眾所周知, 微流控液滴封裝技術存在一個基本限制: 泊松限制. 懸浮在離散相中的微粒或細胞封裝過程中是隨機的接近封裝區, 導致每個液滴中的粒子或細胞數量的不確定性, 液滴封裝粒子數量往往成正態分布, 單粒子的封裝率一般為20% ~ 35%. 泊松分布的存在限制了微流控封裝技術的進一步發展. 近年來, 研究者嘗試開發各種各樣主動或被動的方法去擺脫泊松限制, 從而提高液滴封裝效率. 例如使用慣性排序以及使用激光干擾細胞封裝等. Kemna等通過設計螺旋通道引入迪恩力, 實現了粒子的有序排列, 從而提高封裝率. 然而, 隨著流量條件的改變, 會有多個平衡位置出現, 不利于單粒子封裝. Harrington等設計了雙螺旋結構, 將迪恩夾帶應用于細胞與微粒, 通過定義不同的體積比來實現有效共封裝, 并調節體積比縮放以確定最佳封裝條件. 螺旋結構存在的主要問題是迪恩力會將粒子的平衡位置推向邊緣, 沿著通道邊緣運動的粒子在封裝區會受到液滴頭內部流場的影響卷入通道中心, 從而影響封裝效果. Edd等在高縱橫比通道下嚴格控制粒子有序化的附加程度, 使其產生精確交錯的縱向間隔的兩個液滴列, 并結合復雜的光學設備實現了細胞及微粒受控的高效封裝. 然而, 這種方法缺乏穩健性且容易破壞細胞活性, 難以滿足細胞封裝的生物相容性要求.

需要指出的是, 現有實驗研究大多使用牛頓流體, 而在實際生物醫學應用中的流體介質往往具有明顯的非牛頓性質, 如剪切稀化和黏彈性等. 與牛頓流體相比, 非牛頓性質的引入會影響液滴生成的模態. 由于流量條件以及流體性質的不同, 常見的液滴微流控生成通道中存在5種基本的液滴生成模式: 擠壓、滴流、射、尖端流及尖端多液滴破碎模態. 了解非牛頓液滴生成模態是穩定制備高單分散性非牛頓液滴的前提條件, 而單分散性是保證液滴封裝環境均一的關鍵環節. 在保證單分散液滴生成的基礎上, 若可實現粒子或細胞在離散相中有序排列, 有望大幅提高封裝效率.

在微流控平臺實現微粒的高效封裝之后, 封裝率的檢測也是應用中的重要環節. 傳統的液滴封裝率以手動計算為主. 基于液滴微流控技術的粒子封裝具有高通量特點, 這使得數據量較為龐大, 且液滴密集以及圖片大小和清晰度等問題無疑會為手工計算增加難度. 通過圖像處理實現粒子封裝率的自動計算應是解決之道. 現有算法包括卷積神經網絡、YOLO和DETR等. 其中, 卷積神經網絡適用于處理圖像特別是圖像識別; YOLO算法檢測速度非常快, 但對相互靠近的物體, 以及很小的群體檢測效果不好; DETR算法簡化了目標檢測的網絡架構, 但需要更長的訓練時間來收斂. 新近發展的Deformable DETR算法結合了DETR算法的圖上檢測能力, 也解決了收斂速度慢和特征空間分辨率有限的問題, 有望應用于復雜場景下粒子的封裝率檢測.

基于上述分析, 本文旨在發展基于非牛頓微液滴的粒子封裝及檢測技術. 首先, 基于流動聚焦微通道和聚合物溶液開展非牛頓液滴生成實驗, 研究不同非牛頓液滴生成模態. 其次, 選取兼具剪切稀化與彈性效應的非牛頓流體, 結合粒子慣性-黏彈性排序, 探索不同流量條件和不同液滴生成模態下粒子封裝效率. 最后, 建立Deformable DETR粒子封裝檢測模型, 實現了粒子封裝的高精度檢測. 研究結果可在一定程度上拓展對于液滴微流控基礎理論的認識, 為優化基于非牛頓微液滴的粒子封裝技術提供一定參考.

 材料和方法

1.   流體配置

實驗選取橄欖油作為連續相流體, 其密度和黏度分別為0.92 g/cm3和78 mPa·s; 選取3種聚合物溶液作為離散相流體, 分別為聚環氧乙烷水溶液(PEO)、聚乙烯吡咯烷酮水溶液( PVP)、黃原膠水溶液(XG). 離散相的牛頓流體對比項選用甘油-水混合液( GW, 60 wt.%). 所使用聚合物均配置時未做其他處理. 聚合物溶液采用回旋振蕩器以100 r/min的速率混合1 ~ 2 d; 甘油-水混合液直接按照配比質量分數加入去離子水, 充分搖混即可. 所有配置溶液靜置6 h以上再進行后續實驗.

含粒子的溶液配置時, 將50 mg/mL直徑為20 μm的聚苯乙烯微球(CV 3.1%, 中科雷鳴) 添加到離散相溶液中, 裝入密封容器中進行混勻, 使用工作頻率為40 kHz, 功率為100 W的超聲清洗機對裝載粒子的離散相溶液進行隔水超聲處理, 避免粒子聚團, 配置成粒子濃度為0.5 wt.%的離散相溶液.

2.   芯片設計與加工

圖1展示了本研究所設計的芯片結構示意圖, 微通道的寬度(W)和深度(H)均為 100 μm. 矩形結構盡可能減少壁面對液滴生成的影響, 并且可以基于二維圖像合理地分析液滴生成過程. 在粒子封裝過程中, 為盡可能避免粒子分布受入口切面的影響, 將入口與出口孔徑設計為800 μm. 粒子在通道中雜亂排列, 使得被封裝的粒子具有隨機性, 使粒子封裝存在基本的泊松限制, 在離散相前端通道設計蛇形通道, 蛇形通道的單程長度L1 = 4 mm, 主通道長度L = 2 cm為粒子平衡提供空間距離. 為簡化連續相輸入控制, 將兩側連續相通道在外側合并成一個主入口. 主入口的連續相和離散相的流量分別用 Qc 和 Qd表示. 可知, 連續相兩側通道流量各為Qc/2.

圖  1  芯片結構示意圖及幾何參數

微流控芯片實物如圖2所示. 芯片是基于標準軟光刻技術, 采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制備. 將PDMS與固化劑按10: 1的比例配置并使用玻璃棒攪拌, 直至混合液中充滿小氣泡, 放入真空容器中脫氣之后在掩模板上澆鑄, 在真空容器中進行二次脫氣后放入70 °C干燥箱中烘烤2 h. 烘烤結束之后, 將固化好的PDMS模塊剝離掩模板, 使用切割器PDMS分割出所需模塊, 用外徑1 mm的打孔器在入口和出口處打孔, 然后將PDMS模塊氧等離子體鍵合到玻璃顯微鏡載玻片(25 mm × 75 mm)上, 使用聚乙烯管連接芯片入口與注射器上的25 G針頭, 連接周圍使用專用膠進行加固.

圖  2  芯片實物圖

3.   實驗操作及數據處理

微流控芯片固定在倒置顯微鏡載物臺上, 使用高精度流量泵驅動兩個1 mL注射器分別將離散相和連續相流體以恒定流量通入微通道中. 兩相流體在流動聚焦結構處相遇, 在合適流量條件下, 連續相橄欖油剪切離散相聚合物溶液形成微液滴. 實驗中的流量通過流量泵調節, 流量參數直接讀取即可. 本實驗的流量為Qd = 10 ~ 100 μL/h, Qc = 100 ~ 3000 μL/h. 液滴生成及粒子封裝過程通過高速相機以2000幀/秒的速度記錄. 所有實驗均在室溫下進行. 圖3展示了液滴檢測及封裝率計算模型. 本文驗證了其在單液滴與多液滴場景下粒子封裝率高精度檢測的有效性, 具體過程在后續結果與討論部分詳述.

圖  3  液滴檢測及封裝率計算模型及工作流程

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