1.2 血細(xì)胞分離和采集

血細(xì)胞分離和采集是從全血中把某種特定類(lèi)型的血細(xì)胞(如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等)分離、純化并進(jìn)行采集, 在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究以及血液疾病臨床診斷和治療中具有非常重要的作用。通過(guò)微流控芯片裝置可以對(duì)少量血樣快速、高效地檢測(cè)并分離出不同種類(lèi)的血細(xì)胞。目前, 以微流控芯片為研究平臺(tái)的血細(xì)胞分離采集方法主要有2種:(1)以細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細(xì)胞被動(dòng)分離; (2)通過(guò)在微流控通道中施加外加力場(chǎng)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分離。

1.2.1 以血細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細(xì)胞分離

流體流動(dòng)時(shí), 在黏彈性效應(yīng)和慣性效應(yīng)作用下, 大顆粒將向靠近側(cè)壁的橫向位置遷移。類(lèi)似地, 當(dāng)血液在血管中流動(dòng)時(shí), 尺寸較小的柔性紅細(xì)胞將遷移至血管中間區(qū)域, 而尺寸較大的剛性白細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞將向血管壁周?chē)w移。利用這一特殊的血流動(dòng)力學(xué)特征, 一些課題組設(shè)計(jì)了微流控芯片用于分離并采集不同類(lèi)型的血細(xì)胞。例如, Liu等基于細(xì)胞物理特性和流體黏彈性效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種微流控芯片, 不同大小的細(xì)胞在微流道內(nèi)流動(dòng)至不同的通道:紅細(xì)胞匯聚在中間通道, 而腫瘤細(xì)胞在兩側(cè)通道內(nèi)富集[28], 成功實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞的完全分離。此外, 他們通過(guò)改變作用于囊泡的流體力, 成功實(shí)現(xiàn)了外泌體從胞外囊泡的分離采集。類(lèi)似地, Zhang等利用該方法實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞與血漿的加速分離。Hou等設(shè)計(jì)了一種可以控制液體流動(dòng)的微流控芯片, 通過(guò)不同的管道設(shè)計(jì)與流速調(diào)節(jié)改變微流道內(nèi)的流體力學(xué)特征, 進(jìn)而利用血細(xì)胞在大小、形狀及剛?cè)崃W(xué)特性的不同, 從微量血液樣品中分離出了特定的血細(xì)胞, 包括瘧疾感染的紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及不同種類(lèi)的白細(xì)胞, 最終達(dá)到了檢測(cè)的目的。

圖 8 基于慣性效應(yīng)和黏彈性效應(yīng)設(shè)計(jì)的微流控裝置用于特定類(lèi)型血細(xì)胞的分離采集。(a)微流道內(nèi)瘧疾感染紅細(xì)胞和健康紅細(xì)胞的分離; (b)微流道內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離

1.2.2 通過(guò)在微流控通道中施加外加力場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分離

通過(guò)在微流控通道中施加外加力場(chǎng)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分離的方式主要包括介電電泳力驅(qū)動(dòng)、磁場(chǎng)作用力驅(qū)動(dòng)、超聲波驅(qū)動(dòng)等3種。

(1) 介電電泳力驅(qū)動(dòng)。介電電泳技術(shù)描述的是位于非均勻電場(chǎng)的中性微粒由于介電極化的作用而產(chǎn)生的平移運(yùn)動(dòng)。當(dāng)處于非均勻電場(chǎng)中時(shí), 血細(xì)胞產(chǎn)生極化現(xiàn)象, 其表面會(huì)產(chǎn)生偶極矩, 進(jìn)而在介電電泳力的作用下, 向更強(qiáng)的電場(chǎng)強(qiáng)度方向移動(dòng)(陽(yáng)性介電電泳)或者更弱的電場(chǎng)強(qiáng)度方向移動(dòng)(陰性介電電泳)。由于血細(xì)胞所受介電電泳力的大小取決于血細(xì)胞的大小和形狀、以及懸浮媒介的介電性質(zhì)和黏度特性等因素, 因此在微流控芯片上進(jìn)行介電電泳可實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞的分離。介電電泳細(xì)胞分離技術(shù)具有無(wú)需標(biāo)記、無(wú)需表面修飾和特異性高的特點(diǎn), 因此, 以微流控芯片介電電泳為基礎(chǔ)的分離采集技術(shù)在血細(xì)胞分離領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。例如, Nascimento等利用微流控介電電泳實(shí)現(xiàn)了受寄生蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞與健康紅細(xì)胞的分離采集。當(dāng)紅細(xì)胞受到寄生蟲(chóng)感染后, 其細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)和表面抗原會(huì)發(fā)生一定程度的變化, 同時(shí), 細(xì)胞膜通透性也會(huì)有一定程度的增強(qiáng), 導(dǎo)致感染紅細(xì)胞和健康紅細(xì)胞在介電場(chǎng)中所受介電電泳力的方向和大小都有不同, 進(jìn)而遷移至不同的微通道, 實(shí)現(xiàn)分離采集的目的。

(2) 磁場(chǎng)作用力驅(qū)動(dòng)。對(duì)目標(biāo)血細(xì)胞用微型磁珠進(jìn)行磁性標(biāo)記, 被磁性標(biāo)記的血細(xì)胞流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域時(shí), 磁場(chǎng)作用力使目標(biāo)血細(xì)胞偏離原來(lái)的運(yùn)動(dòng)軌道。不同大小和磁化率的血細(xì)胞流經(jīng)梯度磁場(chǎng)時(shí)所受磁場(chǎng)作用力不同從而實(shí)現(xiàn)分離采集。例如, Karabacak等利用慣性效應(yīng)及磁場(chǎng)效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種微流控芯片裝置, 成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集。這套微流控裝置前半部分的微通道內(nèi)布滿(mǎn)了傾斜的微柱陣列, 尺寸小的紅細(xì)胞/血小板和尺寸大的白細(xì)胞/癌細(xì)胞在微柱陣列中受到慣性升力不同而分離至不同的微通道(圖 9(a))。接下來(lái), 白細(xì)胞和癌細(xì)胞的懸浮液經(jīng)過(guò)中間微通道流經(jīng)磁場(chǎng)區(qū)域, 在磁場(chǎng)作用力和流體驅(qū)動(dòng)力的共同驅(qū)動(dòng)下流向不同的收集通道, 從而將低濃度的癌細(xì)胞從白細(xì)胞中分離出來(lái)(圖 9(a))。Zhao等利用磁流體對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞的作用力不同設(shè)計(jì)了2種微流控裝置(圖 9(b)), 實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞/紅細(xì)胞的分離。另外, 利用磁流體方法可測(cè)量紅細(xì)胞在磁性介質(zhì)中的懸浮情況, 進(jìn)而評(píng)估紅細(xì)胞的變形性能。例如, Tasoglu等將紅細(xì)胞浸入溶液里, 然后注入夾在2個(gè)磁體中間的毛細(xì)管中。磁力從毛細(xì)管底部到頂部垂直減小, 因此紅細(xì)胞的最終平衡位置由細(xì)胞的密度確定。這種方法可以區(qū)分并分離健康和被感染的紅細(xì)胞。

圖 9 微流控通道中細(xì)胞分離示意圖。(a)~(b)基于慣性升力和磁場(chǎng)效應(yīng)從微量血液樣品中實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞的分離采集; (c)~(d)通過(guò)超聲波微流控裝置從血細(xì)胞混合液中分離腫瘤細(xì)胞

(3) 超聲波驅(qū)動(dòng)。對(duì)通過(guò)微通道的流體施加一定角度的聲波, 其產(chǎn)生的壓力可推動(dòng)懸浮在液體中的顆粒移動(dòng)。與正常的血細(xì)胞相比, 聲波對(duì)癌細(xì)胞的推力更大, 故可將腫瘤細(xì)胞推到單獨(dú)的微通道。例如, Ding等人設(shè)計(jì)了一個(gè)外加表面聲波的微流控裝置實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離捕獲。這套微流控裝置的兩端裝有2個(gè)產(chǎn)生聲波的傳感器(圖 9(c))。當(dāng)兩股聲波相遇時(shí), 產(chǎn)生的壓力能推動(dòng)細(xì)胞移動(dòng)。他們利用此方法從乳腺癌患者的血液中成功檢測(cè)到極為罕見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞。Collins等使用高頻聚焦表面聲波垂直作用于流體, 進(jìn)而推動(dòng)流體流動(dòng)并在微通道中產(chǎn)生流體渦流。他們利用流體渦流形成的渦旋實(shí)現(xiàn)了多種不同尺寸顆粒的分離捕獲, 并從紅細(xì)胞和癌細(xì)胞混合液中成功捕獲了乳腺癌細(xì)胞(圖 9(d))。基于微流控超聲波驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分選具有無(wú)需配體、無(wú)需標(biāo)記和生物兼容的特點(diǎn), 同時(shí), 由于每個(gè)細(xì)胞僅在不到1 s的時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷聲波, 因此, 與其他細(xì)胞分離捕獲技術(shù)相比, 該技術(shù)顯得更為溫和, 對(duì)分離血細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。

1.3 血細(xì)胞機(jī)械疲勞損傷

軟物質(zhì)材料會(huì)在長(zhǎng)期的循環(huán)應(yīng)變作用下發(fā)生損傷和斷裂, 也就是機(jī)械疲勞。類(lèi)似的, 在生物細(xì)胞中, 例如紅細(xì)胞, 在循環(huán)應(yīng)力的作用下也會(huì)產(chǎn)生機(jī)械疲勞。Du及其合作者基于介電電泳技術(shù)設(shè)計(jì)了一種包含振幅調(diào)制電極的微流控芯片, 研究了循環(huán)機(jī)械應(yīng)變下單個(gè)紅細(xì)胞的機(jī)械疲勞損傷行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在一定的循環(huán)載荷下, 紅細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生機(jī)械疲勞效應(yīng); 同時(shí), 在相同的累積加載時(shí)間和相同的最大載荷下, 動(dòng)態(tài)循環(huán)載荷比靜態(tài)載荷對(duì)紅細(xì)胞膜的損傷更大。此外, 他們發(fā)現(xiàn)不同的載荷形態(tài)(如方波載荷、擬正弦波載荷等)對(duì)紅細(xì)胞膜損傷的影響程度也有所不同:與擬正弦波載荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比, 循環(huán)方波載荷對(duì)紅細(xì)胞膜機(jī)械變形影響更為顯著。他們還發(fā)現(xiàn)機(jī)械疲勞效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致磁滯和能量耗散, 持續(xù)的機(jī)械疲勞對(duì)血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)功能有著不利影響。這樣的疲勞測(cè)試平臺(tái)可用來(lái)定量表征血液循環(huán)過(guò)程中單個(gè)血細(xì)胞累積的細(xì)胞膜損傷, 幫助人們了解血細(xì)胞的應(yīng)力波動(dòng)對(duì)其生物力學(xué)特性的影響。

2 總結(jié)及展望

紅細(xì)胞變形性能對(duì)血流性質(zhì)有重大影響, 它是決定高切率下血液黏率的關(guān)鍵因素。許多血液病變是由于紅細(xì)胞變形性能低下導(dǎo)致的。例如, 瘧疾感染紅細(xì)胞和貧血癥下鐮狀紅細(xì)胞的變形性能會(huì)減弱, 不利于紅細(xì)胞通過(guò)狹窄毛細(xì)血管; 遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥下球形紅細(xì)胞由于體表比增加進(jìn)而使紅細(xì)胞很難變形。目前, 人們已發(fā)展一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)研究病變紅細(xì)胞的變形性能及生物力學(xué)響應(yīng), 然而, 在單細(xì)胞水平研究紅細(xì)胞的變形和流動(dòng)特征仍面臨很大挑戰(zhàn)。近些年來(lái)迅速發(fā)展的微流控芯片技術(shù)憑借其特有的優(yōu)勢(shì)為健康與疾病中的紅細(xì)胞力學(xué)性能研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷發(fā)展, 如何模擬更復(fù)雜的幾何形態(tài)和更逼真的血流微環(huán)境, 把血細(xì)胞形狀的動(dòng)態(tài)變化和各種疾病的病理變化及臨床表現(xiàn)聯(lián)系起來(lái), 將是未來(lái)工作的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)。

同時(shí), 基于微流控芯片技術(shù)的器官芯片(Organ-on-a-chip)近幾年來(lái)發(fā)展迅速, 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了體外模擬多種活體細(xì)胞、組織及器官微環(huán)境。為適應(yīng)人類(lèi)器官及血管的復(fù)雜性, 未來(lái)的研究需要建立更加復(fù)雜的多器官微流控芯片(Multi-organ-on-a-chip)系統(tǒng), 將不同器官芯片模型應(yīng)用到類(lèi)似人體的血液循環(huán)環(huán)境中。目前熱門(mén)的3D生物打印技術(shù)具有精確的控制能力和個(gè)性化特點(diǎn), 使得"定制"人體組織器官成為可能。通過(guò)在芯片上打印特定帶血管的器官, 可以更好地模擬細(xì)胞、血管及組織微環(huán)境并建立患者特異化(Patient-Specific)的血管及器官模型, 進(jìn)而從細(xì)胞-組織-器官等不同層面多尺度探索相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制, 并進(jìn)行更加系統(tǒng)的藥物毒性檢測(cè)和藥效評(píng)估。

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