3.   基于液滴的共培養(yǎng)技術(shù)研究微生物相互作用

微生物相互作用是微生物群落功能和動態(tài)的主要驅(qū)動因素，利用液滴微流控技術(shù)在液滴中對微生物進行共培養(yǎng)，非常適用于高通量地研究微生物在各種環(huán)境下的相互作用。PARK等首先使用微液滴進行細菌共培養(yǎng)，當兩個交互共生的菌株被封裝進同一個液滴時，它們都可以生存和繁衍。TAN等在液滴中共培養(yǎng)糞便樣本中的亞群落，分離出22個有較強的細菌共生長的液滴，并進行基因組測序以研究細菌亞群落的特征。這一技術(shù)也可用于研究微生物的跨界相互作用。JAROSZ等用液滴微流控技術(shù)共培養(yǎng)酵母和細菌，發(fā)現(xiàn)少數(shù)細菌可誘導酵母的代謝轉(zhuǎn)化，這一策略可用于微生物次級代謝物的篩選。LAM等利用液滴微流控共培養(yǎng)技術(shù)研究肺炎球菌間的基因水平轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)在短期的細胞間相互作用后，發(fā)生了多次重合轉(zhuǎn)移和大塊或大片的轉(zhuǎn)移。HSU等將兩個或三個菌種隨機混合封裝到液滴中進行多個亞群落的平行培養(yǎng)，結(jié)合熒光顯微鏡和計算機快速的測定上千個液滴中每個菌種的絕對豐度，成功構(gòu)建出不同環(huán)境中微生物群落復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

基于液滴的高通量共培養(yǎng)和分離技術(shù)可用于篩選具有抗菌活性的益生菌。利用這一策略，SALESKI等成功從大腸桿菌突變文庫中分離出一株高異丁醇產(chǎn)生能力的菌株。在另一個報道中，研究人員將金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）與西伯利亞熊的口腔微生物組置于微流控液滴中共培養(yǎng)，成功篩選出一株有抗金黃色葡萄球菌活性的芽孢桿菌。

4.   抗生素敏感性試驗

基于微流控的細菌培養(yǎng)方法是進行自動且快速抗生素敏感性試驗的一個很有前景的工具。近年來，多種基于微流控的方法被開發(fā)出來用于抗生素敏感性試驗，比如微室、微通道和基于液滴的方法，其中，基于液滴的方法由于其能產(chǎn)生大規(guī)模的超小體積液滴用于高通量和高敏感性的檢測而被廣泛使用。

BOEDICKER等最早開發(fā)了用于抗生素敏感性試驗的液滴微流控平臺，可在7 h內(nèi)對多種藥物在多個不同的濃度進行試驗。KAUSHIK等開發(fā)了dropFAST平臺，將抗生素和活細胞指示劑刃天青以及單一細菌封裝在皮升級的液滴中，培養(yǎng)1 h后，測定液滴中的熒光強度用于對活細菌進行定量并評估抗生素敏感性。為了進一步增大測試通量，POSTEK等開發(fā)了一種微流控平臺，可以產(chǎn)生一系列乳狀液，每份乳狀液都含有密集的液滴，并通過第三不互溶相彼此分離。單個細菌被封裝在液滴中，每份乳狀液包含不同濃度的抗生素和相同濃度的細菌。這一系統(tǒng)使得在單次實驗中可對單個細胞的抗生素敏感性試驗在一系列抗生素濃度上進行上百次試驗。KANG等設(shè)計了一種由4個集成微液滴陣列組成的平臺，每個微滴陣列承載8000多個對接點，可同時篩選四種抗生素/病原體組合，在15~30 min內(nèi)進行抗生素敏感性評估。

液滴微流控技術(shù)也能用于評估抗病毒藥物。MASHAGHI等設(shè)計了一種用于篩選候選化合物的病毒融合試驗。采用定量熒光探針，在亞秒時間分辨率上測定了甲型流感病毒與微滴中靶脂質(zhì)體的融合動力學數(shù)據(jù)。從候選藥物在病毒融合動力學方面的特征可獲取藥物作用機制的相關(guān)信息。此外，為了確定潛伏期逆轉(zhuǎn)劑對HIV再激活的影響，研究者開發(fā)了一種用于高通量封裝HIV感染細胞和直接鑒定HIV感染細胞的微流控裝置。利用其對從接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者獲得的單個CD4+ T細胞進行分析發(fā)現(xiàn)，潛伏期逆轉(zhuǎn)劑在某些情況下增強了活性細胞的轉(zhuǎn)錄，而在其他情況下增加了轉(zhuǎn)錄活性細胞的數(shù)量。

5.   工程菌株與微生物資源開發(fā)

液滴微流體為菌株改良、代謝產(chǎn)物篩選和生物合成基因簇發(fā)現(xiàn)提供了一個有效的平臺。JIAN等設(shè)計了一種微生物微滴培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在多達200個液滴中自動執(zhí)行微生物培養(yǎng)、生長監(jiān)測和適應(yīng)性進化，在該系統(tǒng)中對甲醇必需型大腸桿菌菌株進行了為期18 d的適應(yīng)性進化，獲得了兩株生長速度比親本菌株更快的菌株。將可能產(chǎn)生氨基酸的菌株和報告菌株封裝在液滴中，可以識別自然分泌氨基酸的菌株，研究人員用該方法分離出了三株突變的乳酸乳球菌菌株，與野生型相比，氨基酸分泌增加了5~10倍。MAHLER等將報告菌株注射到所有液滴中，對來自自然微生物群落的抗生素產(chǎn)生株進行了高通量篩選。

將宏基因組文庫構(gòu)建與液滴篩選相結(jié)合，有助于從微生物中發(fā)現(xiàn)生物合成基因簇。MA等建立了生活自來水樣品中大腸桿菌的宏基因組文庫，結(jié)合液滴微流控技術(shù)，他們鑒定到了一種催化效率高、進化起源與其他脂解酶不同的新型酯酶。相似的手段也被用于從黏液相關(guān)的腸道微生物群中篩選宿主聚糖降解酶類，結(jié)果揭示了腸道細菌尤其是致病菌代謝人類聚糖的新途徑。XU等開發(fā)了一種微流控自動質(zhì)粒文庫富集系統(tǒng)用于對微生物的生物合成基因簇進行分離和測序，該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于從南極土壤宏基因組中分離并測定了Ⅰ型聚酮合酶基因簇序列。

液滴微流控技術(shù)也可用于定向進化，定向進化是蛋白質(zhì)工程中一種常用的方法，通過模擬自然選擇過程，引導蛋白質(zhì)或核酸實現(xiàn)所需功能。液滴微流體技術(shù)能進行高通量分選的優(yōu)勢使其成為進行定向進化的理想平臺。VALLEJO等建立了一種熒光激活的液滴分選裝置，以進化用于合成和修飾人工遺傳聚合物的酶。ZURKE等通過在微液滴中進行單細胞培養(yǎng)，將酶活性測定的靈敏度和DNA回收率提高了一個數(shù)量級，使蛋白質(zhì)工程更易于識別或進化出可應(yīng)用于合成和化學生物學的新酶。

6.   總結(jié)與展望

液滴微流控作為一個高通量高分辨率且高度集成化的新興技術(shù)平臺，可與多種檢測技術(shù)結(jié)合，在從微生物培養(yǎng)到微生物組學研究再到微生物資源開發(fā)利用等方面扮演重要的角色。由于其獨特的優(yōu)勢，液滴微流體技術(shù)有望成為微生物學家探索微生物世界的基礎(chǔ)技術(shù)工具。目前液滴微流控技術(shù)仍面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，液滴微流控技術(shù)用于微生物研究仍有一些技術(shù)局限需要突破，如液滴中物質(zhì)交換能力有限、難以解決不同微生物種類的需氧量差異等問題。此外，還缺乏標準化的設(shè)備和操作流程，只有少量的液滴微流控設(shè)備用于特定需求的分析，大多數(shù)利用液滴微流控技術(shù)的研究仍需要研究人員自己設(shè)計并制作微流控設(shè)備，設(shè)備的制作和操控均存在很大挑戰(zhàn)。因此，未來需要對液滴微流控系統(tǒng)進行自動化和簡約化改進，為其在微生物研究中的應(yīng)用提供全方位、標準化的設(shè)備和操作流程，繼續(xù)創(chuàng)新和改進下游的分析手段。相信隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，在多學科的高度配合下，液滴微流控技術(shù)進一步發(fā)展和成熟直至走進每一個微生物實驗室，服務(wù)微生物學科的研究發(fā)展將成為現(xiàn)實。

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