摘要: 數字聚合酶鏈式反應（PCR）技術近年來發展迅速。與以實時熒光定量PCR為代表的傳統PCR技術相比，數字PCR技術顯著提高了定量分析的精確度和靈敏度。數字PCR的快速發展與近年來微流控技術在數字PCR技術中的廣泛應用有著密切的聯系。早期的研究和商業化產品使用的是大規模集成流路微流控芯片，加工過程復雜且價格高昂。近年來，液滴微流控芯片被應用到數字PCR技術中，它可以在短時間內產生102～107個微液滴，每一個微液滴都是最多只含有一個目的基因片段的PCR反應器。PCR擴增后，通過對單個微液滴的觀察計數，就可以獲得絕對定量的分析數據。本文綜述了不同種類的液滴微流控系統在數字PCR技術中的應用，以及液滴數字PCR微流控芯片在生物、醫藥、環境等領域的應用。

引言

早在1992年，已有學者提出了數字聚合酶鏈式反應(Digital PCR, dPCR)的概念，并且指出其在DNA的定量分析方面具有顯著優勢。但是初期的dPCR技術發展十分緩慢，這是由于如果使用傳統的96孔板或者384孔板進行PCR擴增，需要數個多孔板同時進行擴增，不僅操作復雜，且實驗樣品和試劑的消耗量非常大。在當時的條件下，研究者很難開展數字PCR的研究。此外，在DNA定量研究方面，由于實時熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)等技術的發展和廣泛應用，也使得dPCR技術的發展緩慢。

隨著微流控技術的出現和近年來的高速發展，研究者嘗試將微流控技術與數字PCR技術結合起來。與微流控芯片結合后的dPCR技術的靈敏度和精確度有了很大提高，在單細胞研究、基因測序、醫學診斷、環境監測、食品安等領域得到了越來越多的應用，展現出了廣泛的應用潛力。近年來，還涌現出一批商業化的dPCR檢測設備。本文綜述了近年來dPCR技術及液滴微流控芯片的發展狀況，并介紹了dPCR技術在醫學、生命科學等領域的實際應用情況。

dPCR原理

傳統的實時定量PCR以指數形式體現定量信息，而dPCR技術所能提供的DNA量化信息是以線性的數字化形式體現的。dPCR的原理如圖 1所示，將含有目標基因、引物、聚合酶等的溶液稀釋后，根據實驗需要被分成102~107份不等的溶液(反應單元)，每份溶液中至多只含有一個目的基因拷貝。這些溶液單元經過與傳統的PCR技術相同的熱循環擴增后，對每份溶液進行檢測。如果含有目的基因，則計為“1”(陽性反應)；不含有目的基因，則計為“0”(陰性反應)，這些代表陽性反應的數字“1”和代表陰性反應的數字“0”類似于數字電路中的通和斷兩種狀態，這也是dPCR名稱的由來。最后通過對陽性反應的單元計數可以獲知擴增之前目的基因的絕對數量。考慮到有可能出現擴增前一個反應單元里有兩個或以上目的基因的情況，使用泊松分布進行校正可以進一步增加對擴增前目的基因計量的準確度。

與傳統的PCR技術相比，由于熱循環和熒光探針標記等技術已經較為成熟，dPCR主要的技術難點體現在對稀釋后的反應溶液進行大規模等分的技術上。在對稀釋后的溶液進行等分方面，最初采用了96孔或384孔板的方法，但這種方法試劑消耗量巨大(每孔約5μL)，且可實現的反應單元數量較少。后來盡管在反應單元的數量上有所增加，如Shen等在玻璃基底加工了1280個反應單元，但仍存在溶液等分不能自動完成和反應單元數量較少的問題。直到微流控技術被應用到dPCR領域后，反應單元的數量才得到了爆發式的增長。關于微流控技術在dPCR領域的應用，本文后續部分會詳細介紹。

為了進一步說明dPCR技術的原理，圖 2顯示了dPCR技術在胎兒早期疾病診斷中的應用。圖 2a是檢測過程中一組12塊多孔板中的1塊，具有765個反應單元，每個反應單元的容積為6 nL，含有目標基因、引物、熒光探針等的反應溶液通過微流控技術被均勻送入各個反應單元中。經過PCR擴增后，由TaqMan探針標記的含有目標基因的反應單元發出熒光，可以很容易地觀察到。經過計算機圖像處理，轉換為圖 2b所示的熱點圖(Heat map), 每個紅點代表一個含有目標基因的反應單元，通過熱點圖就可以準確分析出目標基因的數量。圖 2c是作為參考的dPCR的擴增曲線，需要指出的是，dPCR對目標基因的測量并不需要擴增曲線的幫助，而在實時熒光定量PCR檢測中，對目標基因擴增數量的檢測直接依賴于與標準曲線的對比，由于標準曲線與實際樣品擴增效率不同等原因，導致熒光實時定量PCR檢測的準確度偏低。Hindson和Whale等對實時熒光PCR技術和dPCR技術進行了系統對比，結果表明，相比于實時熒光定量PCR，dPCR對目標基因定量檢測的靈敏度、精度、檢測時間等方面有著非常顯著的優勢。在檢測精度方面，dPCR與實時熒光PCR相比，相對標準偏差(RSD)顯著減小，測量精密度提高；在檢測時間方面，如果保持與熒光PCR相同的精度，dPCR的日檢測量增加了7倍。

早期的微流控技術與dPCR的結合應用體現在以集成流路微流控芯片(Integrated fluid circuit, IFC)為基礎的dPCR技術。這種微流控芯片采用多層光刻技術加工而成，具有非常復雜的流路結構以及氣動的微泵與微閥，通過微泵和微閥將溶液送入反應腔陣列，其加工過程復雜，成本非常高，且受到加工技術和成本的限制，IFC芯片可以實現的反應單元數量一般不超過10000個。

近年來，液滴微流控技術的發展給dPCR帶來了新的發展機遇。采用液滴微流控技術，經過高度稀釋的含有模板DNA和引物等的反應溶液可以在微流控芯片中很容易地被分成102~107小液滴，每個體積只有納升甚至皮升的小液滴都是只含有最多一個目的基因的微型反應器，經過PCR擴增后，通過熒光檢測，可以很直觀地定量分析出原始溶液中目的基因的拷貝數量。

與IFC芯片相比，液滴微流控芯片的優勢不止體現在反應單元的數量，其最大優勢在于成本方面：IFC芯片的加工采用接近納米尺度的多層光刻技術，成本非常高；而液滴微流控芯片大多只有一層結構，且加工尺度在微米級，因此大大降低了芯片的加工成本(微流控芯片的加工成本占芯片總成本的大部分)，這對于dPCR技術的發展至關重要。

微流控系統中微液滴的產生方法

如前所述，微流控技術對于dPCR發展的貢獻主要在于可以大規模增加反應單元的數量，通過微流控技術，高效精確地將樣本溶液分割為102~107份。微流控技術對樣本溶液的分割，最初是由氣動微泵、微閥控制分割樣本溶液的IFC芯片，不僅結構較為復雜，加工難度也較大，可以分割的份數也非常有限，單塊芯片的成本非常高。近年來，研究者開始使用微流控系統產生大量微液滴的辦法實現對樣本溶液的分割，每個產生的含有目的基因、探針和引物等的微液滴都可以作為一個獨立的反應單元進行PCR擴增，而微滴產生的速度、數量、體積等均可以通過微流控系統精確控制。相比于IFC芯片，液滴微流控芯片的加工過程簡單，成本低廉，代表了未來微流控與dPCR結合的發展方向。下面將結合微液滴在dPCR領域的應用，簡要介紹使用微流控系統產生及操控微液滴的技術。

通過微流控系統產生大量應用于dPCR技術的微液滴，最常用的方法是乳化技術(Emulsion)，即兩種不相溶的液體混合時，一種液體會以微滴的形式分散在另一種溶液中。微流控芯片可以在微尺度上對一種溶液(分散相)在另外一種不相溶的溶液(連續相)中產生微液滴的過程進行精確控制，繼而獲得大量體積在納升甚至皮升級，且大小均一的微液滴。

圖 3顯示了使用液滴dPCR技術對癌癥基因進行篩選和測序的應用研究。如圖 3所示，在一個T形(T-junction)的微通道中，黃色代表油，藍色代表包含引物、熒光探針以及目標基因等的水溶液。由于兩種液體不相溶，在微通道的液體流動過程中，油在微通道內在向左側流動的過程中對水溶液不斷進行擠壓，作為分散相的水溶液在連續相油的不斷擠壓中被最終剪斷，形成了一個微液滴(本例中體積為2.5 nL)。分散后的微液滴含有至多一個目的基因以及引物、熒光探針等，分散后的液滴可以使用傳統的PCR技術進行擴增，由于油的阻隔，在擴增過程中，每個微液滴都是一個相對獨立的反應單位。

除了圖 3所展示的T形微通道的液滴產生系統，類似的還有Y形、十字形等多種微通道結構，都可以用于產生微液滴。除了乳化法之外，還可以采用流動聚焦(Flow-focusing)等方法產生單/雙/多層包裹的微液滴。采用微流控技術產生微液滴的大小與微通道的尺寸及連續相和分散相的流速、粘度等都有直接關系?，F階段使用微流控技術可以產生的微液滴的體積范圍從0.05 pL到1 nL不等，對應的微液滴直徑為5~120μm，實際應用中可以靈活選擇。文獻中采用的是以油包水(W/O)方式產生的微液滴，根據實驗需要，同樣的微流控系統還可以產生水包油(O/W)的微液滴，甚至氣體包水(W/G)的微液滴。

在連續相液體的選擇方面，多采用礦物油(Mineral oil)，對微液滴形狀的保持和微液滴間的阻隔起到了重要作用，且對微液滴中參與PCR擴增的生物大分子、酶等的活性和結構沒有影響。為了增強液滴產生的穩定性和控制分散相微液滴的大小，有的研究者在礦物油中加入了0.5%~3.0%的表面活性劑。在水或油中添加表面活性劑對微液滴的穩定起到了重要作用，且未發現毒副作用。未來的研究中，可以通過改變微通道表面的物理化學性質等方法(物理/化學修飾)，增加微流控系統產生微液滴的穩定性，從而擺脫對價格昂貴的表面活性劑的依賴，減少對溶液的污染。

微流控芯片材料的選擇與其應用環境有直接關系。目前，在dPCR領域，無論是IFC芯片，還是液滴微流控芯片，通常使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質的微流控芯片。PDMS具有良好的生物相容性和透氣性，且微加工性能良好，但在某些有機溶劑的作用下會發生溶解和變形。根據目前微流控技術發展的總體趨勢，未來非常有可能產生基于熱塑性塑料(如：PMMA、PS、PC等)，甚至紙基等低成本微流控dPCR芯片。

微液滴的高通量生成技術

液滴微流控芯片在dPCR領域的應用是利用了液滴微流控系統可以迅速產生大量的微液滴的優勢。近年來，在產生高通量微液滴的微流控芯片方面進行了大量研究，目前，單一微液滴產生裝置的液滴產生速度可以高達10 kHz，如果將多塊微流控芯片并行使用，或者在一塊微流控芯片上加工數十到數百個微液滴產生裝置，還可以極大提升液滴的產生速度。Nisisako等在一塊圓形的玻璃基底上呈輻射狀排布了128個Y形微液滴產生器，每小時可產生1 L粒徑為96.4μm的微液滴。

圖 4展示了Holtze等制作的高速微液滴發生微流控芯片，芯片采用了軟光刻的方法，使用傳統紫外光刻技術對SU-8進行曝光沖洗后，利用SU-8作為模具，對PDMS進行倒模，最后將PDMS鍵合在玻璃片上制成微流控芯片。他們不僅在連續相的油中添加了表面活性劑，還在分散相的水中也添加了具有良好生物相容性的表面活性劑(PFPE-PEG共聚物)，從而極大提高了微液滴高速產生時的穩定性，液滴的產生速度可以達到30 kHz(圖 4a)。從圖 4b可見，隨著微通道內油流量上升，微液滴的產生速度也迅速上升，產生的微液滴的直徑隨之變小。為了驗證PFPE-PEG共聚物作為表面活性劑的生物兼容性，在微液滴中進行了質粒DNA體外編譯β-Galactosidase酶的實驗，獲得了滿意的效果。

值得注意的是，高通量的微液滴產生技術對微流控芯片系統以及擴增后的液滴熒光檢測都提出了更高的要求。首先，產生高通量液滴的微流控芯片對反應液體進樣的穩定性和連續性都提出了更高要求，這種情況下，反應液體進樣常需要通過價格高昂的恒壓泵實現。其次，高通量的液滴產生微流控系統對芯片的鍵合也提出了更高要求，內部的高壓液體對芯片的鍵合強度要求更高。最后，對液滴的熒光檢測的速度方面也提出了更高要求，檢測系統不僅需要在極短時間內對微流控芯片中按順序排布流動的微液滴進行熒光檢測，還需要高速的數據處理和統計能力。

 dPCR與液滴微流控芯片的結合和應用

目前，基于液滴微流控芯片的dPCR(Droplet digital PCR, ddPCR)已被廣泛應用于疾病檢測、基因診斷、基因測序、食品安全等多個領域。

在疾病檢測和基因診斷方面，Heredia等采用液滴dPCR技術對乳腺癌腫瘤細胞中的表皮生長因子受體(HER2)的表達水平進行了研究。與之前研究者的結果相比，采用dPCR顯著提高了對HER2表達水平的準確度，為研究HER2表達水平與乳腺癌發病之間的關系提供了準確數據。dPCR技術在疾病診斷領域的應用遠不止于乳腺癌領域，在肺癌、結腸癌等疾病的檢測領域，研究者也利用dPCR技術對其相應的標志物(如：EGFR、KRAS等)進行了檢測，從而實現了在基因水平上對疾病診斷的目的。利用dPCR技術的高靈敏度，還可以對微量的游離在血液中的腫瘤導致的CNAs進行檢測，對于癌癥的早期診斷有著重要的意義。實驗表明，利用dPCR技術，可以達到在106個野生型中檢測出一個突變基因的靈敏度。Contente-Cuomo等使用液滴dPCR對微量的游離在細胞外可作為癌癥標志物的DNA片段進行了檢測，驗證了在血液的復雜背景中，利用dPCR技術對循環腫瘤標志物檢測的可行性。

在環境工程和食品安全領域，Bian等采用經過油飽和處理的基于PDMS材料的微流控芯片，對飲用水中E. coliO157和L. monocytogenes兩種細菌進行了dPCR檢測(圖 5)，分別用兩種不同顏色的熒光探針標記兩種細菌，PCR擴增后可以同時對兩種顏色熒光微液滴進行檢測計數，從而得到兩種細菌在初始溶液中的絕對定量結果，用這種方法對飲用水的檢測精度可以達到10 CFU/mL。在食品安全領域，為了適應歐盟對轉基因農作物的嚴格要求，Dobnik等[51]提出并驗證了利用液滴dPCR技術對歐盟境內種植的12種轉基因玉米進行快速檢測的方法。Dany等也使用dPCR—實時熒光PCR聯用技術對食品、飼料、種子中的轉基因成分進行了測定，在提高精度的同時也降低了檢測成本。

在液滴微流控技術與dPCR的結合應用方面也有一些商業化產品，如Bio-Rad公司的QX系列液滴dPCR檢測系統，其中QX100系統中的液滴微流控芯片可以在一次分析中將樣品溶液分成11.2萬~12.8萬個小液滴，每塊芯片的價格僅為24美元。在QX100系統中，使用了前文提到過的十字形的微流道，分散相溶液在連續相油的擠壓中不斷產生小液滴，通過數個液滴產生微流控芯片的并行協作，在短時間內產生了大量的小液滴，每個小液滴就是一個反應容器；PCR熱循環擴增結束后，又使用微流控技術，使小液滴依次通過檢測裝置對其進行熒光檢測，完成計數過程。與之相似，RainDance公司的Rraindrop系統附帶的微流控芯片的8個進樣通道同時工作時，最高可將樣品溶液分為8000萬個pL級的微液滴，每塊微流控芯片的成本也只有80~240美元。相比之下，Fluidigm公司BioMark系統使用的基于IFC技術的微流控芯片中的12個反應單元陣列加起來也僅有9180個反應單元，每塊芯片價格卻高達400美元。由此可見，從單個芯片的價格和對反應溶液分割的份數來看，液滴微流控芯片相比于IFC芯片都擁有巨大的優勢。

典型的商業化液滴dPCR系統的工作原理如圖 6所示，含有目的基因、Taq聚合酶、引物、分子信標(如：TaqMan等)的溶液經過微流控芯片，被分為數百萬個微液滴，分散的微液滴被收集在離心管中進行PCR熱循環擴增，擴增的同時，通過熒光探針/分子信標標記目的基因，最后，微液滴被重新送入微流控芯片中，微液滴依次通過熒光傳感器進行檢測，最后得到數據分析圖。值得一提的是，現階段微液滴一般可以通過熒光探針標記兩種顏色，如果對熒光探針的強度進行控制，基于兩種顏色的探針最多可以達到12個標記的多重分析。

結語和展望

與傳統的依靠標準曲線和循環閾值進行定量檢測的實時熒光PCR技術相比，在目標基因的定量精度和靈敏度方面，dPCR具有非常明顯優勢：通過對溶液的高度稀釋和分割，每份溶液中都至多含有一個目標基因，在擴增后，通過熒光檢測，可以準確定量分析出原始溶液中的目標基因數量。

dPCR技術在基因工程、疾病檢測以及環境工程等領域得到了較為廣泛的應用，無疑是未來PCR技術的發展方向。液滴dPCR是近年來興起的一項新dPCR技術，是微流控技術與dPCR結合產生的新成果。相比于基于IFC的dPCR芯片，液滴dPCR對反應溶液的分割數量增加了上千倍，可以容易地將反應溶液分割為數百萬份含有至多一個目標基因的微液滴，大大提高了定量分析精密度，不僅推動了dPCR在更多領域的應用，且顯著降低了dPCR技術的成本。

目前，包括液滴dPCR在內的整個dPCR技術還處于發展初期，與液滴dPCR相關的液滴微流控芯片技術、多重熒光探針、反應后微液滴的高速檢測等相比還有很大發展的空間。在液滴微流控芯片技術方面，其技術難點在于大規模高通量的液滴產生技術，高通量往往是通過增加芯片中的液體流動速度和采用數塊微流控芯片并行運作實現的，這對芯片的設計、微通道的加工、芯片的鍵合等都提出了更高的要求，是未來技術攻關的重要難點之一。在多重熒光探針的使用方面，多數實驗室研究和商業化產品使用的都是1~2個熒光探針，可以實現對1~2個目標基因的同時檢測。在未來的dPCR技術發展中，提高熒光探針數量必然是發展趨勢之一，在一次dPCR檢測中對多個目標基因進行定量分析，大大提高效率，降低成本，對醫學檢測等領域的應用有著重要意義。前面提到的高通量液滴產生技術和多重熒光探針技術也都對PCR擴增后的熒光檢測系統提出了更高的要求，在非常短的時間內，不僅需要熒光檢測系統對液滴是否具有熒光做出判定，還需要對熒光的顏色做出準確判斷，所以，未來dPCR技術發展中高速熒光檢測和信號處理也是亟待解決的難題。

此外，值得重點關注的是液滴dPCR技術的高成本問題。目前，為了保證內部微流道潔凈，只能一次性使用的液滴微流控芯片的成本仍然過高，使得整個液滴dPCR技術的檢測成本高昂，影響了液滴dPCR技術的普及。微流控芯片成本的絕大部分源自微加工技術和芯片材料，相信未來隨著微流控技術的高速發展，各種低成本的微加工方法的不斷涌現和各類低成本材料的使用，會在很大程度上降低液滴dPCR技術的成本。從降低成本方面考慮，研發應用于液滴dPCR技術中的高通量、低成本微流控芯片也必將是未來的發展方向之一。

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