細胞譜系追蹤是生物學研究中一個長期未解決的問題。微流控技術具有解決這一問題的潛力，因為其能夠以一種快速、可控和高效的方式操縱和處理單細胞。事實上，當與傳統的成像方法相結合時，微流控系統可使實驗人員對單細胞分裂進行長時間追蹤。

基于此，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院（ETH Zürich）的研究人員設計、制造并開發了用于追蹤非貼壁單細胞譜系的自動化圖像引導的微流控平臺。該平臺的基本特征包括：（i）具有用于單細胞捕獲的集成微流控室；（ii）具備長時間監測細胞生長的能力；（iii）具有分離分裂后的姐妹細胞的能力；（iv）可以快速再分配姐妹細胞以監測第二次和第三次分裂事件；（v）能夠提取細胞，并使用大規模平行RNA單細胞測序（MARS-seq）、唯一分子標識符（UMIs）和基于微孔板的單細胞RNA測序（scRNA-seq）流程進行下游轉錄組學分析。相關研究成果近期以“An image-guided microfluidic system for single-cell lineage tracking”為題發表在PLOS ONE期刊上。

圖1 微流控單細胞處理平臺及實驗流程

該研究所開發的微流控裝置由控制層和流體層組成，每一層均由通道網絡構成。微流控裝置內的流體流動采用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的氣動微閥控制。根據控制層和流體層的相對位置，這種微閥可以設計為“上推式”或“下推式”。“上推式”微閥更適用于涉及在更深的流體通道內操縱真核細胞的應用，因為與“下推式”微閥相比，其能夠減少流體的泄漏。而當微流控裝置需要PDMS之外的不同材料作為襯底材料時（例如在載玻片上形成分子圖案），“下推式”微閥更適合。在該研究所設計的微流控裝置中，研究人員使用了一個“上推式”微閥結構，因為該微流控裝置專門用于培養和操縱真核細胞。

此外，該雙層微流控裝置集成了8個腔室，用于兩代姐妹干細胞的長期監測（> 24小時）和追蹤，詳見圖1。首先，通過啟動控制微閥1，可以阻止流體進入捕獲區域，從而將單細胞捕獲在增殖室中。同時，通過打開每個腔室兩側的旁路流道和控制微閥2，可以將新鮮細胞培養基輸送給被捕獲的細胞。

此外，姐妹細胞的分離、將分離后的姐妹細胞重定位到新的捕獲室以及單細胞的提取也在該微流控裝置中進行。具體而言，在分裂之后，姐妹細胞被操縱到一個包含兩個控制微閥的分離區。其中一個控制微閥的驅動確保其中一個細胞可以被驅動到提取區域，而另一個細胞將保持被捕獲，從而成功將姐妹細胞分離。分裂后分離的姐妹細胞在控制微閥的驅動下通過反饋通道流動，隨后被重定位在單獨的捕獲室中。此外，該微流控裝置的提取區域包括兩個可獨立尋址、直徑為1 mm，并且深度為3 mm的開孔，用于收集姐妹細胞。

圖2 單細胞增殖和姐妹細胞重定位

圖3 姐妹細胞提取

為了驗證微流控工作流程的有效性，研究人員利用該微流控裝置對雞紅細胞白血病細胞系（6C2）和雞紅細胞原代祖細胞（T2EC）進行了兩代以上的追蹤，結果表明，兩種細胞的存活率均超過90%。此外，姐妹細胞在分裂后成功分離，并且可以在500 nL的提取室中被成功提取，該提取室與下游單細胞RNA測序分析兼容。

圖4 單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據可視化

綜上所述，在該項研究中，研究人員開發了一種多層微流控裝置和相關實驗流程，用于在單細胞水平上追蹤非貼壁細胞分裂。該微流控平臺能夠在8個獨立控制的增殖室中同時捕獲單細胞，分離分裂后的姐妹細胞并將其提取用于下游分析。研究結果證明，該微流控平臺能夠使用兩種不同的細胞模型（即細胞系和原代細胞）追蹤至少兩代細胞。概念驗證實驗證實雞紅細胞白血病細胞系和雞原代紅細胞祖細胞可以在微流控芯片內增殖，并且其存活率高于90%。分離后的細胞被置于500 nl體積的提取室中，該提取室與下游單細胞RNA測序分析兼容。該研究開發的通用方法可以重現選定的單細胞和提取細胞的系譜信息，同時能夠提供與常規的流式細胞熒光分選技術（FACS）所提供的質量相媲美的數據，以用于后續單細胞RNA測序分析。

總體而言，該研究開發的微流控平臺為單細胞分辨率的單細胞譜系追蹤研究提供了一個強大的自動化平臺，可以用于追蹤包括細胞系和原代細胞在內的非貼壁細胞。在未來，該微流控裝置有望用于包括誘導分化和使用藥物調節基因表達在內的微擾實驗。此外，通過增加每個裝置的平行增殖室數量、提高單細胞捕獲的自動化水平以及實現細胞分裂和重定位的自動檢測，可以顯著提高該微流控裝置的分析通量。

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