D-阿洛酮糖（D-allulose）是一種理想的低能量甜味劑替代品，同時其具有抗高血糖、抗動脈粥樣硬化、降低血脂水平、神經保護和清除活性氧等多種有益的生理功能。生物酶法合成D-阿洛酮糖可以通過酮糖3-差向異構酶（KEase）特異性催化D-果糖C3位的差向異構實現，其具有高特異性、高催化活性等優勢，在D-阿洛酮糖的生產應用中得到廣泛認可。然而，目前已報道鑒定的該家族酶在工業生產條件下催化活性不足且耐受性差，嚴重阻礙了其在生物轉化中的廣泛應用。因此，開發高活性、高耐受性的KEase是實現D-阿洛酮糖工業化生產的關鍵。同時，基于傳統微孔板篩選的模式通常耗時且效率低下，無法滿足酶分子大規模突變體庫高效篩選的需求，因此開發高效的篩選新策略以加速酶分子定向進化進程具有重要的意義。針對上述面臨的問題， 天津科技大學路福平 教授、 秦慧民 教授研究團隊 設計并優化了基于生物傳感器的微液滴超高通量篩選平臺，結合結構指導的理性設計及定向進化，實現了合成D-阿洛酮糖的差向異構酶的高效催化 。相關成果發表于 Angewandte Chemie 上。

研究團隊首先利用特異性響應D-阿洛酮糖的轉錄調控因子PsiR及其調控的啟動子系統搭建了可以檢測體系中D-阿洛酮糖含量的生物傳感器系統，利用綠色熒光蛋白（mEmerald）作為信號輸出模塊，將體系中D-阿洛酮糖的含量與宿主菌熒光信號強度相耦聯。進一步地，通過設計基于微孔板的篩選策略，該研究對調控因子PsiR進行了功能改造，大大改善了生物傳感器系統對D-阿洛酮糖的響應靈敏度。同時，基于結構模型分析，揭示了調控因子改善對D-阿洛酮糖響應靈敏性的分子機理。

圖1. D-阿洛酮糖生物傳感器的設計及優化

進一步地，該研究將上述傳感器系統與KEase表達系統相耦合，實現了目標酶催化活性與宿主菌熒光信號的關聯，搭建了基于熒光檢測的目標酶篩選系統。為了避免目標檢測分子D-阿洛酮糖在篩選反應池中的串擾，本研究借助液滴微流控平臺優秀的單細胞分離及分選能力，結合上述體內酶篩選傳感器系統，構建了KEase酶的微液滴高通量篩選策略：1）目標酶突變體庫的構建；2）突變體庫單細胞及相關試劑液滴共包裹；3）單細胞液滴適溫培養；4）基于液滴內細胞熒光信號的液滴分選，收集陽性液滴；5）回收陽性變體，進行活性分析。

圖2. 基于生物傳感器的微液滴高通量篩選策略

該研究以來自于 Sinorhizobium fredii CCBAU 83666的D-阿洛酮糖3-差向異構酶（SfDAE）為研究對象，通過蛋白晶體結構衍射獲取酶分子結構信息，鑒定了酶分子催化活性口袋重要氨基酸位點（催化殘基、金屬離子結合殘基等），同時運用結構生物學和分子動力學模擬的方法首次識別了該家族酶位于底物結合口袋處的高靈活性蓋子結構，其在底物分子進入酶分子活性口袋的過程中呈現有規律的“打開”和“關閉”兩種主要構象，揭示了其在底物進入酶分子活性口袋的過程中發揮著至關重要的調控作用。

圖3. SfDAE結構分析及分子動力學模擬

基于酶分子結構信息，該研究利用上述微液滴高通量篩選平臺對酶分子進行設計，以優化活性中心及高靈活蓋子區域關鍵氨基酸殘基，同時結合定向進化理論從酶分子全局出發進行高通量定向篩選，在維持其高熱穩定性的同時，將目標酶SfDAE的催化效率提升了17倍。基于結構分析及分子動力學模擬，揭示關鍵氨基酸殘基突變的引入重塑了酶分子活性位點的結構構象和底物口袋的大小，同時改善了蓋子區域的靈活性及擺動范圍，進而闡明了酶分子催化效率提升的分子機理。

圖4. 基于結構的SfDAE理性設計及定向篩選

小結

該研究工作成功設計并優化了基于生物傳感器的微液滴高通量篩選系統，以作為一種低成本、高通量的酶篩選工具，用于定向進化KEase及其他D-阿洛酮糖轉化相關酶。基于酶分子結構信息的解析，首次識別了KEase家族酶位于底物結合口袋處對底物識別具有重要調控作用的蓋子結構，以結構信息為導向的理性設計結合隨機突變的高通量定向篩選，開發了高性能KEase，用于D-阿洛酮糖的高效合成。本研究對D-阿洛酮糖轉化相關酶的功能改造具有指導意義，同時為酶功能改造提供一種高效篩選的新方法。

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