水環境是環境構成要素之一,也是受人類破壞和影響最嚴重的領域,水環境污染已成為當今世界主要環境問題之一,水環境科學研究特別是水環境污染分析備受矚目.水環境污染分析對象種類廣、含量低,因此分析手段必須具備靈敏、準確、高速、自動化等特點.為了解決所面臨的種種現實問題,水環境污染分析動用了現代分析化學中幾乎所有的檢測技術和手段,如使用等離子發射光譜、原子熒光光譜、氣相色譜鄄質譜聯用、高效液相色譜等.在繼續發展大型、精密監測系統的同時,小型便攜式、自動連續、簡易快速的監測技術的研究同樣迫在眉睫.例如,在污染物突發事故或野外連續觀測的現場,由于水體流動的因素,污染物濃度的變化十分迅速,大型固定儀器的使用受到限制,而便攜式儀器和快速、自動連續測定技術就顯得十分重要.在這一領域的研究過程中,微流控芯片技術起到了極其重要的作用.

一.微流控技術在水體污染物分析中的應用

進入水環境的所有污染物質均屬于環境分析的研究對象.按照其毒性、危害和受關注程度分為環境優先污染物和其他環境污染物.微流控芯片技術在水環境污染分析中的研究應用尚處于起步階段,因此多集中于優先污染物的相關報道,主要包括重金屬、營養元素、有機污染物和微生物等.

1.用于水體中重金屬檢測的微流控芯片系統

圖1重金屬檢測微流控芯片系統

隨著工農業的發展,越來越多的重金屬如汞、鎘、鉻、鉛、銅、鋅、鎳、鋇、釩等被排放入水體,不僅會對水生動植物產生毒害作用,還能通過富集作用進入生物鏈,對整個生態環境構成嚴重威脅.對上述重金屬的檢測,雖然可以使用高精度的原子吸收光譜和原子熒光光譜等方法,但是在應對突發性污染物泄露事件,或者對一個區域進行連續監測的情況下,仍需要快速、高效的檢測工具.Green-wood和Greenway使用光刻法搭配濕法刻蝕技術,成功研制了一種微流控芯片.該芯片利用魯米諾發光的性質,成功地對硝酸鈷進行了測定,檢測最低限度為3X10-11mol·L-1.該裝置使用造價低廉的光電探測器,在保證了高敏感度的前提下降低了成本,而且將試劑固定在了微芯片之上,實現了操作的自動化.與此同時,通過簡單的改造之后,該微全分析系統還能成為檢測過氧化氫或者二氧化氮的裝置,并可以與信號傳遞裝置結合起來,成為一種自帶無線信號發射功能的設備.Alves-Segundo等[32]使用發光二極管和光電二極管,搭配低溫共燒陶瓷,制造了一種基于光度檢測的連續流動分析微芯片(圖1A).該裝置使用二苯基甲酰胺作為顯色劑對六價鉻進行測定,在0.1~20mg·L-1的范圍內表現出良好的線性關系,同時其檢測限最低為50μg·L-1.

基于紙的微流控器件近幾年的發展也很迅速[33],相對于具有類似功能的微流控設備[34],它具有操作簡單,不需要外援設備,可多元檢測等優點,有望成為最廉價的分析檢測器件.Hossain和Bren-nan[35]利用β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)在重金屬離子的抑制下會失去活性的性質,配合其他的金屬指示劑,開發出了一種可以用來檢測多種重金屬的紙芯片(圖1B),顯示了良好的靈敏度.

2.營養鹽測定芯片

用于營養鹽測定的微流控芯片系統多數是基于分光光度法的檢測原理,運用現代微細加工技術將各種光電元件加以集成.例如,都柏林城市大學的McGraw等[36]利用鉬酸銨與磷酸鹽反應產生特征黃色或黃綠色這一特點,研制了一種用于水體中磷酸鹽監測的微流控芯片系統.該系統配有數據的發射裝置,可以在目標區域的不同位置分別布置,對該區域的磷酸鹽污染狀況進行全方位的實時監測,檢測限最低為0.3mg·L-1.賈宏新等[37]提出了一種三層雜交結構微流控芯片[玻璃片/聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜/PDMS底片],在玻璃片上加工微反應通道,用PDMS加工氣體滲透膜和具有接受通道的PDMS底片,實現了溶液中NH4+反應、生成的氨氣擴散分離、吸收、溴百里酚藍顯色和光度檢測在微流控芯片上的集成化.理論上任何基于流動注射分析技術-分光光度法的營養鹽測定均可在微流控芯片中實現.但由于微米尺度的微流控芯片通道的吸收光程和光通量均受到很大限制,因此這一類技術的突破點在于芯片上長光程檢測的實現。

此外,利用毛細管電泳的微流控芯片技術在營養鹽的檢測中也得到了良好的運用.Shiddiky等[39]制造了一種基于毛細管電泳技術的微流控芯片,該系統可以在90s內,同時對亞硝酸鹽離子和硝酸鹽離子完成檢測,最低檢測限分別為(0.09±0.007)μmol·L-1(NO2-)和(0.08±0.009)μmol·L-1(NO3-).Sieben等[40]也做了相似的研究,制造了一種用來檢測亞硝酸鹽的微流控裝置,其檢測限為14nmol·L-1.

3.有機污染物分析芯片

水體中除含有無機污染物外,更大量的是有機污染物,它們以毒性和使水中溶解氧減少的方式對生態系統產生影響,危害人體健康.因此有機污染物的數量是評價水體污染狀況的極為重要的指標.這一類污染物由于其含量較低,通常需要進行前期的預處理,微流控芯片的優點體現在可以將前期的預處理以及后期的檢測進行集成,并且具有較高的萃取/富集效率.Benhabib等[41]利用基于光譜分析技術的微流控芯片,對多環芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)進行了檢測,其檢測范圍為0.1μg·L-1~400mg·L-1.Nie等[42]制造了一種用介孔材料(CMK-3)修飾的碳盤電極的電化學檢測芯片,可以檢測水中的硝基苯類化合物(nitroaroma-ticcompounds,NACs).該裝置使用毛細管電泳裝置來分離4種硝基苯類化合物,在樣本沒有經過復雜預處理的情況下,其在飲用水中的最低檢測限能達到3.0~4.7μmol·L-1.Shen等[43]制造了一種微流控芯片,使用毛細管凝膠電泳技術,搭配激光誘導熒光檢測法來檢測水體中的溶解有機碳(dissolvedor-ganiccarbon,DOC).通過對日野川(HinoRiver)和琵琶湖(BiwaLake)的水樣分析得知,在經過孔徑為0.45μm的濾膜之后,可以檢測出濃度為1~2mg·L-1的DOC.Ha等[44]利用基于毛細管電泳鄄安培檢測系統的微流控芯片,對雙酚A為代表的一些內分泌干擾物進行了檢測.該系統的主要結構是采用普魯士藍修飾的氧化銦錫(ITO)電極,并配合彎曲的微通道.經過微通道的有效分離之后,該系統對于雙酚A的檢測限為59nmol·L-1.然而該芯片目前只應用于檢測被泡沫塑料污染過的水體,這僅僅是對于內分泌干擾素檢測的初級階段,對于科研工作者而言,下一步要做的工作是對更廣泛的污染物檢測進行深入的研究.

4.微生物檢測芯片

水體中的微生物按其粒徑,屬于顆粒有機碳(particularorganiccarbon,POC)范圍,其種群豐度可以反映水體生態特征和一些重要的污染狀況(如大腸桿菌可反映水體受糞便污染的程度、赤潮藻豐度可預警或指示赤潮,而嗜油菌豐度可顯示水體受溢油危害程度等),是水體生態調查中的常規監測指標.在其測定過程中,流式細胞術是最為準確、快速的方法.但其設備昂貴、體積龐大、需要專人操作,不適應現場、連續監測要求.基于鞘流式流體控制的微流控芯片的出現在一定程度上克服了這些局限,并可能實現儀器的集成化、小型化、自動化和便攜化.其測定原理與流式細胞儀相似.首先對細胞進行熒光標記(可發出自體熒光的無需標記),采用電動力、壓力或空氣夾流等形成鞘流的方式實現細胞進樣,細胞流經激光誘導熒光檢測區后,根據檢測到的熒光信號的有無和強弱進行計數,并可借助多種控制方式(如電[45]、光鑷[46]和泵閥[47]等)進一步完成細胞分選。

除了上述基于流式細胞術原理的微流控芯片以外,免疫分析和分子雜交也是較為常用的技術.Bey-or等[48]開發出了一種固定了免疫磁珠的微流控芯片,可以從稀釋的樣本中檢測并分離出大腸桿菌O157：H7.通過芯片外的PCR預處理技術和芯片中的毛細電泳技術,可以有效提高捕獲細胞的效率.該芯片對于微生物的捕捉效率為70%,其檢測限為2cfu·μL-1.與此相似,Dharmasiri等[49]制造出了一種以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為材質,并且經過多克隆抗體pAb修飾的微流控多通道芯片,可以同時檢測8個不同的樣本,也可以對同一個樣本進行8個平行檢測,檢測下限為6~10cfu·mL-1.該芯片的優點可以對樣品進行預濃縮和富集,避免了潛在污染物對目標分析的干擾.Metfies等[50]利用分子雜交技術,開發出一種使用rRNA作為探針的微流控芯片.該芯片擁有兩段18SrRNA作為探針,可以形成兩個特異性檢測區域,在將微生物破碎,提取總DNA并進行PCR以后,成功地對亞歷山大藻(Alex-andriumostenfeldii)進行了檢測.

二、基于微流控芯片的水污染生物監測系統

水環境污染分析除了要闡明水體污染物質的組成、狀態和含量以外,還要分析水體污染狀況并對水環境的生態風險做出評價.在此過程中,為了補充物理、化學分析方法的不足,主要采用生物監測法.在水污染的生物監測法中指示生物可采用水生微生物、植物和動物等.由于芯片尺寸微小,通道是微米級別的,與細菌、微藻類相匹配.因此,該類生物被較多應用在基于微流控芯片的水污染生物監測系統中.這里按照所測定指標的不同,分別進行總結.

1.微藻生長分析芯片系統

水污染引起水體各種物理、化學條件的改變,這些改變直接影響到生活在水中的藻類的生長、繁殖.因此,藻類生長抑制(algaegrowthinhibition)是生物法監測地表水和地下水水質的基本參數.作者所在課題組設計并制作了一種集成污染物濃度梯度生成器和擴散式藻類培養單元的微流控芯片(圖2)[51].該芯片以PDMS為基本材質,中間夾雜聚碳酸酯膜,可在線完成污染物梯度添加、微藻培養、受激和檢測過程,極大地簡化了藻類毒性試驗操作過程.試驗選取5種常見微藻,包括3種綠藻、1種硅藻和1種紅藻,進行微流控芯片培養.結果表明,微流控芯片微藻培養顯示了與實驗室常規微藻培養類似的種群增殖曲線,從而首次證明了以PDMS材質微流控芯片作為微藻實驗平臺的可行性.同時,以青島大扁藻(Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis)、亞心扁藻(Platymonassubcordiformis)、小球藻(Chlorella)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)為受試對象,研究其在重金屬脅迫下的表觀增殖率的變化情況,顯示了良好的劑量-效應關系.

圖2海洋微藻培養及毒性篩選微流控芯片示意圖及實物圖

2.微生物自體熒光檢測芯片

很多微生物具有內源熒光物質,可通過靈敏的激光誘導熒光技術來進行研究,從而獲得關于新陳代謝狀態的信息以及其他各種微生物中存在的信息.如葉綠素熒光技術,就是以細胞內葉綠素作為天然探針,以光合作用理論為基礎,研究和探測生物光合生理狀況及各種外界因子對其細微影響的新型活體測定和診斷技術,具有快速、靈敏、易行、對細胞無損傷等優點.

Podola等[52]研制了一種非選擇性膜固定式微藻傳感器芯片系統(圖3A),該芯片以玻璃纖維板作為基底層,用來提供培養基和污染物,上面封接上雙層賽璐珞膜,雙層膜之間夾有12個圓微藻固定區域,并以常規IMAGING-PAM葉綠素熒光儀做為檢測器.該芯片系統的優勢在于可在12個區域固定不同微藻,利用其對于不同污染物敏感程度的差異,對污染物種類做出初步判斷.其不足在于檢測系統仍外圍化,集成度不高.

圖3微藻葉綠素熒光檢測芯片

Lefvre等[53]在這方面工作中取得了較大的研究進展,制造了一種基于PDMS材質,集成了有機發光二極管(OLED)和有機光電探測器(OPD)的微流控芯片(圖3B).以萊茵衣藻(Chlamydomonasrein-hardtii)為指示對象,檢測水體中除草劑敵草隆,其檢測限能低至11nmol·L-1.盡管該微流控芯片能在很低的濃度下對污染物進行監測,然而它在很多方面依然有改進和提升的空間:1)減少基片厚度,并集成顯微鏡頭陣列,可以有效改善OLED和OPD之間的聯系,并提高接受信號的質量;2)縮短OLED發射的波長,使其對海藻的刺激作用更有效率;3)采用對污染物敏感度更高的海藻,進一步降低檢測限.

此外,Garca-Alonso等[54]開發出一種基于酵母熒光的微流控芯片.該芯片是利用釀酒酵母(Sac-charomycescerevisiae)暴露在基因毒素的條件下能表達出綠色熒光蛋白的性質,對甲基-甲磺酸鹽進行了有效的檢測.試驗結果表明,每單位面積的熒光強度與甲基-甲磺酸鹽暴露的時間呈正相關.

3.微生物活性的熒光分析芯片

微生物的細胞活性可以直接從細胞層面反映水污染狀況,可利用外源熒光探針分析法進行測定.在這方面研究工作中,流式細胞術的出現起到了重要的推動作用,眾多研究者以細菌和微藻為受試生物,結合多種熒光探針評價了重金屬、農藥和有機污染物的生物毒性。

由于流式細胞儀設備昂貴、體積龐大,難以適應現場要求.因此,作者所在課題組在微生物活性熒光分析芯片的研制方面做了積極的探索,設計并制作了一種基于PDMS材質的微流控芯片[51],尺寸為63mmX63mm,以熒光素二乙酸酯(fluoresceindiac-etate,FDA)為探針,測定重金屬Cu脅迫下小球藻(Chlorella)和紫球藻(Porphyridiumcruentum)的酯酶活性,呈現出良好的劑量-效應關系.目前,該芯片系統仍采用外源檢測設備,包括熒光倒置顯微鏡和CCD成像系統,因此,只適用于實驗室研究.下一步工作的方向是檢測設備,包括OLED和OPD的微流控芯片的集成,開發適于現場檢測的小型化儀器.

在儀器集成化方面,Fukuba等[57]取得一定的研究進展.他們利用海洋中微生物活性與其所在環境中的ATP含量(包括溶解與未溶解的)密切相關的原理,使用熒光素-熒光素酶(luciferin-luciferase)體系,定量分析了海水中ATP的含量,以及在ATP數量下降時周圍環境中微生物的消退狀況.通過使用集成式原位ATP裝置“IISA(integratedinsituana-lyzer)-ATP冶(圖4A、B)進行分析,在2X10-12~2X10-8mol·L-1的范圍內,ATP的檢測限為1.1X10-11mol·L-1,通過在日本東京灣和沖繩島的原位測試顯示,ATP的含量分別為2.7X10-10和3.4X10-10mol·L-1.

圖4集成式原位ATP裝置

近些年來,隨著各種分析和監測手段的發展,微流控芯片技術取得了巨大的進步.考慮到了解人類活動對生態環境影響程度的需求日益增加,越來越多的科研組織已經認識到微流控裝置在環境監測和生態分析中的優勢,并投入力量進行研發.

由于其低廉的造價以及易于操作等優點,微流控設備擁有巨大的成為便攜式裝置的潛力.我們認為,未來微流控分析裝置的發展,將著眼于兩個方面:一是生產功能高度集成的微流控芯片系統或簡單易用的紙芯片,這樣可以使更多沒有經過專門培訓的人員對微流控裝置進行操作;二是與傳統的分析設備相比,便攜化依然是微流控芯片的最大優點.但是目前受技術限制,微流控設備在檢測精度及抵抗外界因素干擾等問題上,與傳統設備仍有一定的差距,這在某種程度上限制了微流控設備的使用.然后在應對諸如突發生態污染事故、或者需要大面積估計一個區域某項生化指標等情況下,微流控芯片仍具有相當的優勢.科研人員現在正在努力在保持便攜性的基礎上,使微流控裝置提高測量精度,并具有處理更加復雜樣品的能力.

從目前的發展水平來看,微流控芯片已經突破了其發展初期在加工技術和基本流控技術上的主要難關,正在進入一個更深入的基礎研究、廣泛擴大應用領域及深度產業化的轉折時期.在相關技術方面,比如材料表面改性、流體驅動與控制、試樣反應與混合、接口技術、系統集成等方面,也取得了卓有成效的進展.從生態環境分析與檢測的角度來看,現有技術水平的微流控芯片不僅可以監測并分析水環境中諸多不同類別的污染物,比如重金屬、營養鹽、有機污染物,以及有害微生物等,還可以對微藻數量、ATP含量等進行定量的分析.上述指標都可以從不同角度反映出水環境的生態狀況,為進一步的研究提供第一手的數據.因此,可以預計的是,微流控芯片將在不遠的將來取代當前分析實驗室中的很多設備,并進入生產現場、監測區域等成為主流的污染監測和生態分析工具,使便攜式“個人實驗室冶成為現實.

文章來源：應 用 生 態 學 報 2014 年 4 月 第 25 卷 第 4 期 《微流控芯片在水環境污染分析中的應用》作者：王 虎 魏俊峰 鄭國俠

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