微流控芯片應用于電化學阻抗生物被膜
生物被膜是細菌及其自身分泌的胞外聚合物組成的微生物群落，其形成是受多種機制共同調控的多階段動態過程，具有較強的耐藥性且難以清除，給醫療、食品等行業帶來了巨大的威脅。
生物被膜是為適應環境而在有生命或無生命的物體表面形成的有組織的微生物群落。生物被膜可謂是細菌的天然保護屏障，為細菌提供了相對穩定的生存環境。生物被膜在自然界中廣泛存在，對人類生產生活的各個方面都有重要影響。據統計，65%的醫源性感染與生物被膜相關，生物被膜內細菌的耐藥性是醫療行業所面臨的重大難題之一。此外，生物被膜會引發水污染影響飲用水質，導致食品污染。
生物被膜的形成不是一蹴而就的，是一個細菌粘附到基質表面，并不斷增殖分裂形成微菌落直至生物被膜發展成熟，最后生物被膜破裂細菌重新定植的多階段動態過程。生物被膜的形成既受外界環境的影響，又受細菌內部基因的調控，群感效應作為細菌進行信息傳遞的重要機制，它在生物被膜的形成中起到了重要的調節作用。
1生物被膜的結構特點及形成過程
過去人們常認為細菌傾向以游離的狀態存在，是以單細胞的方式生存，直到17世紀，VanLeeuwenhoek發現固著在牙齒上的細菌是以細菌群落的形式存在的，生物被膜的理論才逐漸被人們所認可[9]。生物被膜研究之父Costerton將生物被膜定義為由粘附在有生命或無生命表面上并包裹在自分泌的胞外聚合物的細菌組成的微生物群落[4]。生物被膜廣泛存在于自然界中，其更傾向于形成在潮濕的物體表面，如食品加工設備、醫療器械等[10]。生物被膜可有效地保護其中的細菌，使得膜內細菌具有更強地抵御過酸過堿、高溫、高滲透壓等不利生存環境的能力和更強的耐藥性，有利于細菌更好地適應周圍環境。
生物被膜由粘附在物體表面的細菌及胞外基質組成。胞外基質主要指的是胞外聚合物(EPS)，它是生物被膜的主要化學成分，胞外基質也包含蛋白質、DNA等物質[13]。例如，銅綠假單胞菌生物被膜胞外多糖主要是Pel、Psl和海藻酸鹽，eDNA也是銅綠假單胞菌生物被膜的重要組成成分，其作用是維持生物被膜的穩定性[14]。生物被膜不是細菌及胞外聚合物(EPS)的簡單聚合，而具有復雜的架構。例如，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌生物被膜中點綴有開放的水通道，這些水通道有利于生物被膜中營養物質及代謝廢物的交換[15]。
生物被膜的形成是個動態而復雜的過程。這一過程可劃分為幾個主要的階段：可逆粘附期、不可逆粘附期、微菌落的形成、生物被膜成熟期以及散播期[16-17](圖1)。在可逆粘附期，細菌通過鞭毛或菌毛可逆地粘附到物體表面，在這一時期細菌可以脫離表面重新回到浮游狀態；之后細菌表面蛋白和胞外聚合物(EPS)協助細菌粘附到固體表面，可逆粘附轉變為不可逆粘附[18]，粘附期是生物被膜形成的關鍵時期，它是細菌由浮游狀態到生物被膜形成的轉折點；隨后粘附的細菌不斷增殖分裂，胞外聚合物(EPS)逐漸增多，形成微菌落直到形成成熟的生物被膜，在成熟的生物被膜中胞外聚合物(EPS)占生物被膜干重的90%，胞外聚合物(EPS)把生物被膜中的細菌粘附在一起，維持著生物被膜的三維結構，使得膜內細菌具有更強的耐藥性，以及抵御不良環境的能力，如增強生物被膜內細菌對環境中有害金屬離子的抗干擾能力[19-20]，同時胞外聚合物(EPS)可積累群感效應信號分子、胞外酶、細菌次級代謝產物，為細菌提供了信息交流的場所[21]；最后，生物被膜內細菌從成熟的膜中逃離，成為浮游菌，重新定植到新的表面，到達散播期，散播期不僅是上一個生物被膜形成周期的結束，而且是下一個生物被膜周期的開始[22]。有趣的是，研究發現生物被膜的結構隨外界環境的改變而改變，如銅綠假單胞菌在氧氣充足的條件下形成的生物被膜呈“蘑菇狀”，而在無氧條件下可形成三維“網狀”結構的生物被膜[23]。
圖1生物被膜形成過程示意圖
2.微流控芯片應用于電化學阻抗生物被膜檢測
微流控芯片可集成不同的生化功能單元及實現高靈敏度、高通量檢測，具有樣品需求量小、操作簡便的優勢，提供比常規體系更加穩定的微環境，其用于生物被膜的檢測具有很大優勢。將細菌引入到微流控芯片的微通道中，在微流控芯片電極檢測區形成生物被膜，可對其進行原位阻抗檢測。此外，微流控芯片允許在人為可控的條件下研究生物被膜的生長情況，為生物被膜研究及在線監測提供了良好的平臺。在此，我們詳細介紹了近幾年來文獻報道的利用電化學阻抗檢測生物被膜的微流控芯片。
Ben-Yoav等[77]設計了由2個上下平行放置的氧化銦錫涂層電極(ITO)組裝而成的微流控芯片裝置，利用多聚物加工出橢圓形電解槽，在電解槽的底部和頂部分別留有矩形凹槽便于放置氧化銦錫涂層電極，分別在電解槽兩側打孔，便于向電解槽注入細菌培養液以及排除廢液。將大腸桿菌菌液通入到該芯片中，完成細菌在氧化銦錫涂層電極上的粘附和形成生物被膜，再插入Ag/AgCl電極作為參比電極，與上下2個平行放置的氧化銦錫涂層電極構成三電極體系進行阻抗測試，利用等效電路模型分析了由大腸桿菌粘附及其生物被膜生長引起的電容和電阻的變化情況，發現培養0–23h電容值升高而電阻值下降，之后電容值下降而電阻值升高，電容及電阻值的變化情況與大腸桿菌生物被膜的生長發展過程密切相關(圖3C)。
Zheng等[78]采用光刻技術在聚乙烯對苯二酸酯(PET)基質上先后蒸發濺射一層鉻層和金層，制作出3個不同尺寸的金參比電極和5個不同尺寸的金工作電極，可通過改變工作電極和參比電極的尺寸大小和兩者之間的距離，對電化學阻抗測試操作條件進行優化；之后將生物相容性良好、穩定性良好的聚吡咯(ppy)修飾到金電極表面，增強金電極對生物被膜粘附能力。將聚碳酸酯電化學流動池和包含電極的基質材料進行組裝，實現外部培養基及菌液的注入，對銅綠假單胞菌的生物被膜進行了長達232h的原位阻抗信號監測，用等效電路模型進行擬合計算，發現修飾聚吡咯的金電極與未修飾的金電極相比，對等效電路中的電荷轉移阻抗Rct具有更高的靈敏度(圖3A)。
Pires等[79]設計了基于金電極陣列的多通道微流控芯片，該芯片由1條上游參比通道和1條下游測量通道構成，測量通道中4個相同的金工作電極可同時監測銅綠假單胞菌生物被膜的發展變化引起的阻抗信號，這既可減少因局部環境不同造成的實驗誤差，又可實現多通道的并行檢測。他們利用此芯片對銅綠假單胞菌生物被膜進行了原位實時阻抗監測，并通過測試通道內電流隨著培養時間的變化情況評估生物被膜內細菌的生活狀態。此外，還評價了殺菌劑疊氮化鈉的殺菌效果及對生物被膜的清除效果，由阻抗測試和電流測試結果，得出疊氮化鈉有一定的殺菌效果，但不能完全瓦解已形成的生物被膜(圖3B)。
近年來，在微流控芯片微通道里利用叉指微電極開展了基于電化學阻抗檢測生物被膜的生長情況。Settu等[80]采用微機電加工技術將4個相同的叉指微電極集成到玻璃基片上，再使用硅橡膠粘合劑將聚苯乙烯腔體整合到基片上部，實現外部培養液及菌液的引入，對含大腸桿菌尿液樣本進行了12h的監測，利用等效電路模型分析了隨細菌培養時間延長所導致的阻抗信號的變化情況，發現Cdl隨著培養時間延長顯示出減少趨勢，大腸桿菌的粘附及其生物被膜的形成是造成其變化的主要原因(圖3D)。Estrada-Leypon等[81]設計了用于金黃色葡萄球菌生物被膜原位實時檢測的微流控電化學阻抗芯片，該芯片基片包含兩種叉指微電極、參比電極、對電極以及測試K+、Na+的PE電極，芯片蓋片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作，其中兩種叉指微電極用于金黃色葡萄球菌生物被膜的阻抗測試。他們利用有限元法對矩形叉指電極的幾何尺寸進行了優化，并將優化后的矩形叉指微電極與圓形叉指微電極獲得的生物被膜阻抗信號進行比較，發現矩形叉指微電極的檢測靈敏度得到了提高，并將顯微觀測技術與阻抗技術相結合，同時觀測和檢測金黃色葡萄球菌生物被膜的生長情況(圖3F)。
圖3微流控芯片電化學阻抗檢測生物被膜實例
生物被膜的形成會受到周圍環境因素的影響，如培養基、溫度等，滿足生物被膜生長所需培養基的流動狀態也會影響生物被膜的結構[82-83]，在流動狀態下形成的生物被膜與生物被膜造成感染的環境更加接近。利用微流控技術在流動狀態下研究生物被膜的形成更有價值。Zarabadi等[84]將石墨工作電極及石墨參比電極剪切成長條狀，再通過電沉積法制作金工作電極，將3個電極用雙面膠粘合于硅基片上，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆筑到模具上制作出微通道再與含3個電極的硅基片貼合，成功構建實驗所需微流控芯片裝置(圖3E)。利用此微流控芯片裝置分別對流動狀態下微通道拐角及中心處銅綠假單胞菌形成的生物被膜進行了長達65h的在線監測，并采用等效電路模型對微通道拐角及中心處獲得的生物被膜阻抗信號進行擬合分析，發現隨培養時間的延長，微通道拐角及中心處擬合得到的生物被膜電容Cb均先增加后減少，生物被膜電阻Rb均呈現降低趨勢，但相比微通道中心，微通道拐角處擬合得到的生物被膜電阻Rb較大，可能是由于兩處形成的生物被膜結構存在差異。
綜上所述，不同的細菌種類成膜能力及其形成時間會存在差異，電化學阻抗是通過獲取生物被膜響應的阻抗信號進行檢測，阻抗信號本身不具有特異性。但是，不同的細菌生物被膜響應的阻抗信號有所不同，我們可通過控制及優化阻抗檢測的相關參數，由阻抗相關參數對不同種細菌形成的生物被膜進行區分。電極的材料構型及等效電路分析模型是應用電化學阻抗檢測生物被膜的關鍵。相同細菌在不同的電極表面處生物被膜的形成情況也可能存在差異，對生物被膜檢測具有高靈敏度且易于粘附細菌的電極材料及電極結構設計有待進一步研究。針對不同的生物被膜阻抗檢測體系，會有不同的等效電路分析模型，且模型選擇不同，擬合得到的生物被膜相關電容及電阻結果也存在差異。細菌生物被膜的形成過程分為可逆粘附期、不可逆粘附期、成熟期及散播期，處于不同時期的生物被膜具有不同的結構，因此不同時刻獲得的生物被膜阻抗譜圖呈現出規律性的變化趨勢，等效電路擬合得到的生物被膜相關電容及電阻也會呈現出一定的變化規律，但目前的研究還未能清晰地由阻抗分析結果嚴格區分生物被膜所處的生長周期。所以今后，深入解析生物被膜特征阻抗信號并建立生物被膜與阻抗分析結果的關聯模型是完善電化學阻抗檢測生物被膜研究的一個重點。微流控芯片具有便攜、易于功能化及集成化的特點，如何充分發揮微流控芯片本身的優勢，并將其與電化學阻抗技術有機結合起來應用到生物被膜的檢測及生物被膜形成機制的研究中，是今后具有特色的研究方向之一。
3.總結及展望
自人類認識到細菌不單是以個體的形式存在，還會以群體的方式即生物被膜的形式存在以來，生物被膜的研究就一直備受關注。生物被膜的形成既受到周圍環境因素的影響，又受到細菌內基因的調控。細菌群感效應是一種調節生物被膜形成的重要機制。當前，生物被膜的檢測方法顯得尤為重要，它是解決由生物被膜引發院內感染及食品污染等問題的基礎。結晶紫染色、激光共聚焦(CLSM)顯微觀測等方法雖可對生物被膜的結構進行表征，但不能滿足對生物被膜動態形成過程的持續在線檢測。此時，電化學阻抗以其無標、無損、原位持續在線檢測的優勢，應用到生物被膜動態形成過程的檢測中恰到好處。在生物被膜阻抗檢測中，電極的選擇是決定檢測靈敏度的關鍵，一方面，可對普通電極表面進行化學修飾以提高生物被膜阻抗信號響應靈敏度；另一方面，設計制作超靈敏微電極，并將微電極集成到微流控芯片中，合理布局微流控芯片功能區，即可提高生物被膜電化學阻抗檢測靈敏度，又可發揮出微流控芯片本身的優勢，以實現生物被膜形成過程的高通量檢測。除此之外，微流控芯片微通道微環境中受外界干擾小，可對流體流速等條件進行人為操縱，具有模擬人體內環境的潛能,微流控芯片為電化學阻抗研究體內生物被膜在肺部、腸道等部位的感染及生物被膜形成情況提供了良好的操作平臺。總之，將微流控芯片與電化學阻抗結合在生物被膜檢測方面較常規體系具有很大優勢。今后，用于生物被膜阻抗檢測的高靈敏電極結構設計及電極修飾、滿足生物被膜在不同環境下檢測的微流控芯片設計是極具前景和重大意義的研究方向。
文獻：劉露露 等《生物被膜的形成及其電化學阻抗檢測》http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170264
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標簽: 生物被膜 電化學阻抗