負壓驅動皮升級等溫核酸精確定量微流控芯片
數字核酸定量技術的迅速發展在精準定量方面已經展現出絕對的優勢, 將被廣泛應用于醫療衛生領域和基礎研究中, 例如癌癥早期診斷[1-4]、產前診斷[5]、單細胞分析[6]、病原菌檢測[7]、食品安全[8]、高通量測序[9]、單核苷酸多態性[10]等領域。目前, 已經商品化的數字核酸定量技術為數字PCR芯片系統, 主要是液滴型和孔板型兩種。
孔板型以Life-Tech QuantStudioTM 3D數字PCR系統為代表, 液滴型以Bio-Red QX200微液滴數字PCR系統為代表。這些商業化的數字PCR反應系統均需特定儀器輔助進樣或產生液滴，以及進行結果判讀。儀器成本高, 且操作復雜, 不適用于普通實驗室常規應用, 更難用于災害現場即時診斷和條件落后的偏遠地區。這兩種商業化芯片的微反應個數都在20 000左右, 微反應的體積為納升級。對于數字PCR來說, 隨著微反應數量的增加, 其靈敏度、精確度和動態范圍都會得到提高[11]。降低微反應的體積可以提高單拷貝檢測效率, 降低污染, 增加通量, 降低試劑消耗[12]。
等溫擴增技術作為另外一種核酸檢測技術, 與PCR相比有簡單快速、特異性強、靈敏度高、無需溫度循環的優點[13], 終點檢測可以利用濁度[14]和離子指示劑[15]顏色變化進行可視化檢測, 也可通過核酸嵌入染料SG (SYBR GreenⅠ) 進行實時熒光檢測。本研究組開發了一種等溫多底物自配引發擴增技術(isothermal multiple self-matching-initiated amplification, IMSA)[16]。IMSA共有3對引物, 分別是一對外引物DsF/DsR, 一對內引物FIT/RIT和一對莖引物SteF/SteR, 其中外引物和內引物均是混合式引物。IMSA擴增可分為兩個階段:一是原始自我配對結構(self-matching structure, SMS) 的生成; 二是基于SMS的自我循環擴增(cycling amplification)。IMSA和環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 均具有同樣的優點:(1) 特異性強; (2) 靈敏度高; (3) 擴增效率高; (4) 結果易判讀; (5) 可擺脫儀器, 適合現場檢測; (6) 檢測時間短。由于IMSA和LAMP的引物設計和擴增原理不同, IMSA的靈敏度比LAMP更高[16]。同時, IMSA體系中羥基萘酚藍(hydroxynaphtholblue, HNB) 和SG的雙熒光指示系統已被證明可用于微流控芯片, 且有比SG的單色熒光更好的指示性能[17]。
本文在本研究組前期研發的自吸式微流控芯片[18, 19]基礎上設計了新的結構, 增加了反應小室的密度, 縮小了其體積, 大大增加了芯片單位面積的反應小室數量, 提高了芯片核酸定量的性能。并結合雙熒光顯色的IMSA反應系統[17], 開發了結合雙熒光IMSA擴增的高密度皮升級微流控核酸定量芯片。芯片用多層軟光刻技術制成, 以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS) 和玻璃為材料。以HBV質粒為模板進行芯片上的定量測試, 實現了對模板的精確定量。本裝置具有定量精確、靈敏、快捷、操作簡單等優勢, 可用于核酸精準定量檢測。
一、實驗部分
1.1 儀器、試劑與材料
MGL96G型PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司); Maestro Ex IN-VIVO IMAGING SYSTEM熒光成像儀(美國CRI Maestro公司); IX71型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司); H94-25C型單面光刻機(中國四川南光公司); SU-8 2025及SU-8 3025負性光膠(美國MicroChem公司); PDMS (美國Dow Corning公司); 三甲基氯硅烷(中國阿拉丁公司); SYBR Green I及無核酸酶水(美國Life Technologies公司); 羥基萘酚藍(HNB，商品目錄號63451-35-4，中國Lemongreen公司); Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8 U/ μL), dNTPs (10 mmol/L), MgSO4(100 mmol/L), 和10×等溫擴增緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH4)2SO4, 2 mmol/L MgSO4, 0.1%(v/v) Tween-20)(美國New England BioLabs公司); 甜菜堿(商品目錄號107-43-7，英國Sigma-Aldrich公司); HBV質粒(中國生工公司)。
1.2 實驗條件
1.2.1 等溫核酸定量微流控芯片的制作
首先制作芯片模具。用Corel DRAWX4繪制芯片圖形, 如圖 1a所示。芯片模具采用多層軟光刻技術制成。在干凈的硅片上旋涂SU-8 3025, 厚度30 μm, 于95 ℃烘烤15 min。然后將有微通道圖樣的掩膜緊貼在光膠上, 紫外曝光20 s。再次升溫至95 ℃, 保持5 min。旋涂SU-8 2025, 厚度90 μm, 于95 ℃烘烤25 min。將小室圖樣掩膜貼在光膠上, 利用對準設備將掩膜與已曝光的通道層圖案對準。紫外照射34 s。于65 ℃和95 ℃分別烘烤3 min和12 min。最后, 將硅片浸泡在顯影液中, 洗去未曝光的光膠。最后升溫至250 ℃, 烘烤30 min, 將兩次曝光圖形融合。
芯片構成如圖 1b所示。制作芯片前將模具在三甲基氯硅烷中浸泡5 min, 使模具表面硅烷化。首先制作空白層, 作為芯片的封底, 防止核酸吸附到蓋玻片上。將PDMS單體(A) 和固化劑(B) 按照30 : 1(質量比, 下同) 混合均勻, 并真空脫氣, 然后旋涂在干凈的硅片上, 厚約50 μm, 于90 ℃固化20 min。配制質量比為5A : 1B的PDMS預聚物, 傾倒在模具上, 旋涂200 μm, 于90 ℃烘烤1 min固化, 為反應小室層。在反應小室層上旋涂一層納米防蒸發層。將剩余的PDMS預聚物倒在納米防蒸發層上, 于90 ℃固化1 h, 制作支撐層, 為反應小室提供負壓, 并且有利于脫模。固化后, 納米防蒸發層被嵌入支撐層和反應小室層中間, 3層融合成芯片主體。脫模, 打孔, 將芯片主體圖案一面貼在空白層上, 于100 ℃烘烤40 min使兩層PDMS融合。用等離子體處理空白層和干凈的蓋玻片, 進行貼合, 芯片組裝完成。蓋玻片用來維持負壓狀態下芯片的形狀。最后配制10A : 1B的PDMS預聚物, 于90 ℃固化1 h, 制作真空儲氣層。將其貼在出樣口處, 提供持續的負壓將熱凝固油相吸入通道, 封閉反應小室。
1.2.2 擴增體系配置和進樣
20 μL反應體系中含有2 μL 10×等溫擴增緩沖液、0.2 μmol/L外引物DsF和DsR、0.8 μmol/L內引物FIT和RIT、1.6 μmol/L莖引物SteF和SteR、1.4 mmol/L dNTPs、8 U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、0.8 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO4、0.4 μL 50× SYBR Green I和240 μmol/L HNB、2.0 μL稀釋至1 000拷貝/ μL的HBV質粒, 剩余體積用無核酸酶水補齊。陰性對照用無核酸酶水代替模板。引物和模板序列參照文獻[17]。
配制10 A : 1B的PDMS 1.1 g, 加入4 g硅油(50 cSt), 混勻真空脫氣, 作為封閉小室的油相。將芯片表面用膠帶貼合, 以延長負壓保持時間。芯片真空脫氣30 min后刺破進樣口的膠帶, 用移液器吸頭將20 μL配制好的IMSA反應混合液加入進樣孔。并將配制好的硅油加到反應液的上層。在負壓的作用下, 反應液進入芯片, 精確分配到各個反應小室, 見圖 2a。隨后油相進入通道, 將通道中的反應液排出, 封閉小室, 見圖 2b。最后將芯片的進口和出口封閉。
1.2.3 反應條件和數據采集
芯片在平板PCR儀上于62 ℃進行擴增反應, 反應時間60 min。擴增完成后分別在熒光成像儀和熒光倒置顯微鏡下檢測芯片的反應結果。455 nm藍光激發熒光, 發射光透過495 nm長波透鏡, 通過電荷耦合元件(CCD, charge-coupled device) 圖像傳感器進行熒光圖像和數據采集。用Image J軟件分析熒光圖像, 統計陽性擴增個數。利用泊松分布原理計算待檢測目標的分子數目。
二、結果與討論
2.1 等溫擴增微流控芯片
本文中的等溫擴增芯片實際尺寸40 mm×55 mm, 厚度約3 mm。共有3個樣品通道, 每個樣品進入4個樣品反應區, 共計12個反應區, 每個反應區有10 048個反應小室, 共有120 576個反應小室, 芯片反應室的密度達7 000個/cm2。每個小室的尺寸為50 μm×50 μm×120 μm, 反應體積為300 pL, 整張芯片的載樣量為36 μL。根據Heyries等[12]在文獻中給出的動態范圍計算公式, 該芯片理論上可檢測模板的動態范圍為6個數量級, 可檢測的最大模板量為1.13×106拷貝。芯片材料為PDMS和玻璃, 具有較好的透光性。芯片實物見圖 3。
2.2 納米防蒸發層性能研究
由于PDMS的氣透性及長時間在62 ℃保溫會引起反應液水分的蒸發, 少量的蒸發對于微量反應體系就可能造成嚴重結果。特別是反應區域邊緣的小室, 蒸發尤為嚴重(見圖 4a)。本文采用一種納米防蒸發涂層嵌入到反應小室的上方, 防止蒸發。在整個反應過程中, 芯片內處于蒸發平衡。該納米涂層可以在小室上方形成一層透過屏障, 從而有效阻斷水蒸氣的散失, 維持蒸發平衡, 達到抑制蒸發的目的(見圖 4b)。
2.3 等溫擴增反應結果
IMSA反應結束后, 分別使用IX71型熒光倒置顯微鏡和Maestro Ex IN-VIVO熒光成像儀進行熒光檢測。SG在455 nm藍色激發光下會發出綠色熒光, 最大發射波長為520 nm。經過等溫IMSA反應后, 陽性小室的綠色熒光大幅增強。熒光顯微鏡下的結果如圖 5a所示。亮綠色為含有模板的陽性擴增小室, 暗綠色為無模板的陰性小室。同時, 陽性反應小室與相鄰陰性小室間熒光的差異明顯, 說明熱凝固油相有很好的封閉小室的作用, 并無交叉污染現象。
本實驗中加入的HNB可實現熒光可視化檢測。由于顯微鏡為窄帶濾光片, HNB的紅色熒光(最大發射波長為610 nm) 被過濾, 但是在熒光成像系統中呈現明顯的雙色熒光, 如圖 5b所示。綠色小室為含目標片段的陽性擴增小室, 紅色小室為不含目標片段的陰性小室, 因此可以通過顏色區分小室中是否含有模板, 實現可視化分辨。且熒光強度有明顯的差異(見圖 5c)。雙熒光系統中, 陽性熒光的指示染料SG是一種核酸嵌入型熒光染料, 雖有雙鏈選擇性, 但由于等溫擴增中的引物較多, 所以有明顯的背景熒光, 需要加入較多的HNB以掩蓋綠色熒光[17]。本研究組已經開發了一種雙向置換熒光探針用以解決該問題[20], 已在96孔板上使用, 降低了背景熒光的強度, 有很好的反應效果。在微流控芯片上的效果尚待驗證。
本文采用雙熒光指示法, 由于HNB的存在, 含有模板的陽性小室擴增前為紅色, 擴增后顯示綠色, 而無模板的陰性小室一直為紅色。因此在進行陽性小室計數時, 可以很容易根據顏色區分小室中是否含有待測模板, 與只有SG的單色熒光相比, 不需劃定閾值。本文用稀釋至1 000拷貝/ μL的HBV質粒作為模板, 檢驗芯片定量的準確性。圖 6a是熒光成像系統采集的反應結果圖像；圖 6b為陰性對照, 反應區域中無陽性擴增, 全部呈現陰性。圖 6中為一個反應區的圖像, 有小室10 048個, 每個小室的反應體積為300 pL。該區域共有陽性亮點287個。另外3個區域的陽性亮點為858個。
2.4 核酸精確定量
核酸定量結果用泊松分布原理進行計算。泊松分布公式為P(n, λ)=λn/(eλ×n!), n為每個反應通道中的核酸分子數, λ為核酸分子數與反應小室數的比值, P為實際的陽性小室的比例, 即陽性小室與總反應小室的比值。在沒有模板存在時, 泊松分布公式為P(n=0, λ)=1/eλ; 有模板存在時為P(n＞0, λ)=1-P(n=0, λ)=1-1/eλ。令陽性反應的小室個數為W, 本次反應中的核酸模板數為X。因此在本芯片上每個反應通道的P=W/40 192, λ=X/40 192。泊松分布公式變為W/40 192=1-1/eX/40 192, 所以每個反應通道中的核算模板的拷貝數X=-ln [(40 192-W)/40 192]×40 192。由于核酸分子隨機性的分配, 一個陽性反應小室中可能含有不止一個拷貝的模板。因此該公式的意義在于將該反應通道中的模板分子數進行校正, 以得出準確數值。再根據小室個數、每個小室的體積以及稀釋倍數計算出原始模板的濃度。本次反應計算出加入的模板濃度為946拷貝/ μL。在本文中用到的模板濃度用紫外分光光度法測定, 稀釋至1 000拷貝/ μL。兩者有差異的原因有可能是模板斷裂、有雜質或稀釋。針對該問題可利用其他核酸定量系統進行后續檢測。
三、結論
本文采用新的芯片結構, 設計制作的利用PDMS儲存負壓為動力的皮升級核酸精確定量微流控芯片實現了樣品精確分配。隨后熱凝固油相將小室封閉, 進樣過程無需泵和閥及其他儀器輔助, 擴增反應快速, 無需熱循環, 并且具有可精確定量、便攜、快捷、操作簡單等優勢。芯片采用的氟硅烷納米涂層可以有效地阻止反應過程中水蒸氣的散失, 保證了數字HBV-IMSA的正常進行, 實現了目標分子的精確定量。應用雙熒光顯色系統, 無需劃定閾值, 可以通過顏色變化區分陰性和陽性小室, 降低了數據處理的難度。芯片上含有120 576個反應小室, 可以分成12個含有約10 000小室的區域, 一個普通PCR熱板可同時滿足兩個芯片反應, 因此可以同時檢測24個樣本。本芯片不但可以實現精確定量和分子診斷, 而且增加了實驗密度, 提高了通量, 促進了數字核酸定量芯片的應用。另外, 本研究組[21]已經研制出基于智能手機的便攜式溫控和圖像采集平臺, 如配合高分辨率CCD進行數據采集, 將極大地提高芯片在災害現場和不發達地區的利用程度。
文獻來源： ＤＯＩ： １０．３７２４ ／ ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１６．１０００５
作者：吳文帥、丁雄、牟穎（科學網科學網轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）