引物：在Tris緩沖液中，引物可以低溫保存相當長的時間。除非有核酸酶的污染，引物一般非常穩(wěn)定。筆者使用過10 年前的引物，仍然好用。問題的關鍵在于您的引物設計是否合理，使用過程是否規(guī)范。如果您懷疑引物有問題，可以選擇重合。如果重合后，還沒有改善，請查其他 原因。引物到用戶手頭前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丟掉，引物溶解后可以測定一下OD，將所有引物的濃度調(diào)整到一致，對實驗有一定幫助。

       高溫聚合酶：高溫聚合酶是非常穩(wěn)定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶擴增是有差異的，活性定量和標示未必相同。選用表現(xiàn)一貫穩(wěn)定的酶，而不是最便宜的。

       dNTP: dNTP是PCR擴增體系中最不穩(wěn)定的，反復凍融會使dNTP發(fā)生降解。dNTP是由 dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩爾組成，但是他們的穩(wěn)定性不同，發(fā)生降解的程度不同，導致4種dNTP的濃度不一致，即使不發(fā)生降解，4 種 dNTP如果濃度不等，PCR效率和正確率都會受到影響。建議分裝小包裝，減少反復動容凍融的次數(shù)。

       緩沖液：緩沖液一般不容易出問題，只是使用前需要徹底融化混勻使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的緩沖液。緩沖液中可以加入適量的甘油、DMSO等增強劑，目的是改善高GC含量等疑難模板的擴增。

       Mg2+:是TAQ活性所必須的，濃度過高過低對反應都有比較大的影響。過低（<1mM），合成效率會下降，過高（>3mM），非特異性會加大。很多因素會使Mg2+的實際濃度受到影響，如TE中的EDTA, 反應用的dNTP等都會螯和Mg.

       溫度：變性和退火溫度是主要需要考慮的。變性溫度過高（一般在90-94C），時間過長（一般45-60秒足夠），酶的活性會受到影響，同時影響產(chǎn)率。對于退火溫度，過低非特異性擴增增加，過高產(chǎn)率會下降。需要根據(jù)引物的長度，用途，組成確定退火溫度和時間。

       模板：PCR 的關鍵之一，模板不是越多越好?？梢酝ㄟ^倍比稀釋來確定合適的濃度。純度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的試劑存在。模板的pH值接近中性為合適，否則會影響擴增體系的pH值。

      （轉(zhuǎn)自：蘇州汶昌芯片官網(wǎng)）