自從1985年P(guān)CR技術(shù)首次應(yīng)用于遺傳病基因診斷以來，已有近百種遺傳病可用PCR 技術(shù)進(jìn)行診斷和產(chǎn)前診斷，利用PCR 技術(shù)診斷遺傳病的途徑有五個，① 基因突變位點 的直接檢出 ② 篩查與遺傳病 ③ 有關(guān)的點突變 ④ 遺傳多態(tài)性標(biāo)記連鎖分析間接診斷 ⑤ 利用cmRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行分析或直接分析cmRNA。傳統(tǒng)的基因診斷技術(shù)主要是以基因探針技術(shù)為基礎(chǔ)而建立的一些檢測方法，包括 Southerninnouthern印跡雜交，RFLP為，它們可直接分析基因的缺失和重排，亦可利 用RFLP時行連鎖分析，但由于這些技術(shù)操作繁瑣，探針來源困難所需設(shè)劑昂貴，且要用同抗素.完成一項診斷需要的時間亦較長，因此難于滿足臨床診斷的要求，限制了它在臨床上的應(yīng)用。PCR 技術(shù)是一種在體外的海促DNA合成技術(shù)，它能在短時間內(nèi)將靶DNA 擴增百萬倍，而且操用簡便，省時，準(zhǔn)確性也高，它不僅能直檢突變基因，而且可與其它技術(shù)結(jié)合，使其診斷的準(zhǔn)確性幾達(dá)100%。而且不同同位素操作，能最大限度的滿足臨床診斷的需要。因而它已成為目前遺傳病診斷的產(chǎn)前診斷的主要手段.。

       一、PCR 技術(shù)診斷遺傳病的基本條件 　　

       PCR 技術(shù)的基本原理是利用一對引物為介導(dǎo)，在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的技術(shù)，從生化的角度來看，它是一種海促反應(yīng)，因此其反應(yīng)的過程中必須有酶的底物， 在這里酶為DNA聚合酶，沒酶是有耐熱性，底物為4種脫氯乙磷酸核菌酸。它所需要的 另一條件為引物，引物是根據(jù)已知的基因片段合成的一段20時左順的互解序列，因此，要進(jìn)行PCR 檢測，除了具備酶，底物及其它基本因素外，利用已知的基因結(jié)構(gòu)合 成一對引物是PCR 診斷遺傳病的最基本條件，也就是說，說遺傳病的基因結(jié)構(gòu)必須部 分或全部清楚。

       二、利用PCR 技術(shù)診斷遺傳病的途徑

       (一) PCR 技術(shù)直接診斷遺傳病 　

       對于由基因缺失突變引起的遺傳病可利用缺失區(qū)域還側(cè)的DNA序列引物直接擴增 該區(qū)域，看有無特異性的擴增產(chǎn)物，這對缺失部位固定的片段檢測非常準(zhǔn)確簡便，只 需一對引物即可完成，而對于哪些缺失部位異質(zhì)的基因則可利用多對引物進(jìn)行多重PCR ，然后檢查缺失帶。對基因的重排來說，可通過用RT-PCR 檢測mRNA的融合情況來檢 出，括入亦可用PCR 方法來檢出，當(dāng)點突變影響到限制內(nèi)性切酶切點時，可用PCR -RFL P進(jìn)行分析，即將擴增產(chǎn)物用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶切割，然后據(jù)電泳圖譜復(fù)制判斷有無內(nèi)切 酶切點的改變，它比傳統(tǒng)的RFLP檢測法快速簡便，且不受同位素的危害。若突變優(yōu)點 及性質(zhì)已知，可用PCR -ASO，3'特異PCR 及引物鐿爭法進(jìn)行確定，而對于突變優(yōu)點不清 楚或突變優(yōu)點多變的基因則可用PCR -SSCP，DGGE，CDGE，TGGE，PCR -RNSE切割，化簡 錯配切割，異源雙鏈分析長久法進(jìn)行篩選與遺傳病有關(guān)的點突變，再用PCR 循環(huán)直接測序確定突變部位和性質(zhì)。

       (二) 利用連鎖分析間接診斷遺傳病 　　

       在有的遺傳病其基因結(jié)構(gòu)龐大，基因的分子病理改變復(fù)雜或不清楚，或異質(zhì)性較 高，利用PCR 技術(shù)直接檢測與遺傳病有關(guān)的基因點突變有一定的困難.常常利用一些基 因內(nèi)或其旁側(cè)的一些多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，以間接判斷遺傳病，常以PCR 方法進(jìn) 行檢測的多態(tài)性標(biāo)記有以下兩種：

       1、PCR -RFLP 　　

       在人類基因組中存在著許多限制性內(nèi)切酶切點，這些切點在人群中具有明顯的遺 傳變態(tài)性.因此可用已知DNA序列的基因內(nèi)或其旁側(cè)序列中的酶切位點多態(tài)性以PCR 方 法來檢測.PCR 擴增后用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行切割相應(yīng)的擴增產(chǎn)物，通過用瓊脂糖蔌聚丙 烯胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行電泳，分析酶切位點多態(tài)性，在家庭或黃間進(jìn)行連鎖分析.需 要注意的是，在用PCR -RFLP進(jìn)行連鎖分析時應(yīng)選擇那些雜合頻率多，即具有較高多態(tài) 信息量的酶切位點多態(tài)性.亦可采用多個多生酶切位點聯(lián)合應(yīng)用。

       2、Amp-FLP 　　

       在人類基因組中，除RFLP可作為遺傳標(biāo)記外還有一有用的多態(tài)性標(biāo)記，即VNTR(數(shù) 目可變的串聯(lián)重復(fù)序列，和STR(短的串聯(lián)重復(fù)序列)。VNTR的特征是其重復(fù)的核心區(qū)內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)單位為6-40nt，重復(fù)次斷在不同個體有所不同重復(fù)次數(shù)變化亦較大，一般 在幾次到上每次之間。STR的核心重復(fù)單痊為2-5時，其中由雙核苷酸重復(fù)(CA)n或(GT) n(n從10-60次)構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)稱為VNDR.有意義的是，這些串聯(lián)重復(fù)序列在人群中具 有高度的遺傳多態(tài)性，人群中的雜合子比例在50%以上，最高的可達(dá)90%以上，因此它仍可提供更多的多態(tài)信息量.VNTR和STR可用其兩端的序列合成引物，用PCR 進(jìn)行擴 增，PAGE＋銀染堅爾比即Amp-FLP，加之這些片段呈孟德爾或遺傳，因此用之作為連鎖分析的標(biāo)記具有重要價值。目前Amp-FLP已廣泛應(yīng)用多種遺傳病的連鎖分析如DMD/B MD，DKU等.最近幾年的研究還發(fā)現(xiàn)，已可是核苷酸重復(fù)的長度變異可導(dǎo)致許多人類疾病。目前已證實的的與人類疾病有關(guān)的致病性重復(fù)之聯(lián)核苷酸有脆性×染色體綜合征 (CGG)>52，肌強直性營養(yǎng)不良DM(CTG)>50。 利用串聯(lián)重復(fù)區(qū)所測序列合成的引物即可對這些遺傳病時行基因診斷.。

       三、PCR 技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

       (一) PCR 技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的地位 　

       傳統(tǒng)的產(chǎn)前基因診斷主要依賴于以探針為基礎(chǔ)的Southernblotting及RFLP，以此 可診斷缺失型突變及個別的點突變.但由于其操作的復(fù)雜性及儀器設(shè)備的限制，耗時長，準(zhǔn)確性不高，尚需同抗素標(biāo)記，因而大大的限制了它所的應(yīng)用.自從80年未PCR 技 術(shù)而始應(yīng)用于產(chǎn)前基因診斷以來，隨著該技術(shù)的發(fā)展，愈來愈受到人們的重視和歡迎。就目前來看，它已成為遺傳病產(chǎn)前基因診斷的最常用技術(shù).以此技術(shù)為基礎(chǔ)的各種突變基因檢測方法已成為遺傳病基因診斷的主要手段。

       (二) PCR 產(chǎn)前基因診斷的途徑 　　

       1、產(chǎn)前基因診斷胎兒標(biāo)本的來源 　　

       由于PCR 技術(shù)本身的特點，即可不短時間內(nèi)將微量的DNA擴增數(shù)百萬倍，因此它適應(yīng)于各種來源的DNA標(biāo)本?！　?/span>

      (1) 羊水穿刺，在如15周后可經(jīng)母親脆壁穿刺獲羊水，其內(nèi)含有大量的胎兒脫細(xì) 胞5-10ml羊水即可獲得足夠量的PCR 分析DNA樣品. 　　

      (2) 絨毛采樣，在如早期(9-12周)經(jīng)陰道在B超引導(dǎo)采取絨毛樣品，它含有豐富的 DNA. 　　

      (3) 胎兒血液采集:有簡條途徑:胎兒臍靜脈穿刺，胎兒鎖采集. 　　

      (4) 胎兒活檢:可用穿刺取樣，亦可經(jīng)胎兒鏡取樣.可在始17-19周進(jìn)行 　　

      (5) 母外周血分離胎兒細(xì)胞，目前已用于胎兒性別的預(yù)測. 　　

      (6) 宮頸刷取細(xì)胞. 　　

      (7) 著床前取細(xì)胞 　　

      2、DNA的抽提:不同組織來源有其不同的提取方法。　

      3、DNA的擴增及檢測 　　

       根據(jù)不同的突變及檢測目的采用不同的檢測方法，但需要注意的定防止1個染造 成的假陽性結(jié)果。目前利用PCR 技術(shù)能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的遺傳病有多種，常常采用多種 方法聯(lián)合應(yīng)用，如連銀分析與突變點直接根態(tài)聯(lián)合應(yīng)用，PCR 與Southern印跡雜交聯(lián) 合應(yīng)用高，以求最下限度的精確。