芯片雜交是DNA芯片技術中除DNA方陣構建外最重要的一步。雜交時選擇的條件要使成千上萬對的雜交反應中的最大多數處于最佳狀態中，也就是說要使得盡可能多的正確配對物都不遺漏(假陰性盡可能少)，有錯配的雜交降低至最低(假陽性盡量少)，這是非常難以達到的境界。

　　 目前雜交是提高芯片在實際應用中的準確性的關鍵步驟之一。雜交條件的構建要根據芯片的實際情況進行最優化。

　 　雜交反應是一個復雜的過程，受很多因素的影響，而雜交反應的質量和效率直接關系到檢測結果的準確性。這些影響因素包括：(1)寡核苷酸探針密度的影響。 低覆蓋率使雜交信號減弱，而過高的覆蓋率會造成相鄰探針之間的雜交干擾。(2)支持介質與雜交序列間的間隔序列長度的影響。研究表明當間隔序列長度提高到 15個寡核苷酸時雜交信號顯著增強。有研究表明，選擇合適長度的間隔序列，可使雜交信號增強150倍。(3)雜交序列長度的影響。在雜交反應中經常發生堿 基錯配現象，區分正常配對的互補復合物與單個或2個堿基的錯配形成的復合物，主要依賴于形成的復合物的穩定性不同，而雜交序列的長度是影響復合物穩定性的 一個重要因素，一般說來，短的雜交序列更容易區分堿基的錯配，但復合物的穩定性要差一些;而長雜交序列形成的復合物穩定，而區分堿基錯配能力要差一些。研 究表明，12、15、20個堿基產生的雜交信號強度接近，但15個堿基的雜交序列區分錯配堿基效果最好。(4)GC含量的影響。GC含量不同的序列其復合 物的穩定性也不同。(5)探針濃度的影響。以凝膠為支持介質的芯片，提高了寡核苷酸的濃度，在膠內進行的雜交更象在液相中進行的雜交反應，這些因素提高了 對錯配堿基的分辨率，同時也提高了芯片檢測的靈敏度。(6)核酸二級結構的影響。在使用凝膠作為支持介質時，單鏈核酸越長，則樣品進入凝膠單元的時間越 長，也就越容易形成鏈內二級結構從而影響其與芯片上探針的雜交，因而樣品制備過程中，對核酸的片段化處理，不僅可提高雜交信號的強度，還可提高雜交速度。