微流控芯片(microfluidics)又稱芯片實驗室(labonachip),是將化學和生物等領域所涉及的樣品制備、反應、分離和檢測等基本操作單元集成到幾個平方厘米大小的具有微米級通道結構的芯片上,采用可控流體,完成常規化學和生物實驗室的各種功能的一種微技術平臺。微流控芯片具有小型化、集成化、高通量、低能耗、分析快速等特性。自20世紀90年代初,微流控芯片以芯片毛細管電泳的形式出現以來,目前已廣泛應用于生物、醫學、環保和新藥研究等領域。

有別于以靜態親和雜交為基礎的傳統生物芯片,微流控芯片采用微流體控制技術,為動態生物分析提供了一個嶄新的技術平臺。微流控芯片在生物領域的應用可分為分子水平和細胞水平。細胞是生物體結構和功能的基本單位,一切有機體(除病毒外)都由細胞構成,對細胞的深入研究是揭開生命奧秘和治療疾病的關鍵所在。雖然以毛細管電泳和流式細胞儀為代表的細胞分析儀器被普遍應用,但功能單一,而且存在各自的不足。例如,毛細管電泳不易對細胞操控和處理,流式細胞儀耗費大量樣品等。微流控芯片在細胞學研究方面具有以下一些優點:第一,微流控芯片通道尺寸(10~100μm)與單個細胞直徑(10~20μm)大小相近,便于對細胞進行操控;第二,微流控芯片的多維網絡結構形成相對封閉的環境,更接近生理狀態下細胞的生存環境;第三,微流控芯片可以滿足高通量細胞分析的需要,可同時獲取大量的生物學信息;第四,微流控芯片上多種操作單元靈活組合,使得細胞進樣、培養、捕獲、裂解和分離檢測等過程在一塊芯片上即可完成;第五,微流控芯片為平板式幾何構型,更方便進行觀察;第六,芯片上傳熱和傳質快,有利于熱量和物質的擴散。由于微流控芯片能在試驗條件下模擬生理條件,為在單細胞和多細胞水平更好地研究細胞提供了一個全新的技術平臺。本文對近年來微流控芯片在細胞生物學研究中的一些主要應用,包括細胞的培養、分選、裂解、凋亡、計數、遷移、單細胞捕獲和細胞間相互作用等進行了綜述。

1.細胞培養

細胞培養是細胞生物學、組織工程、生物醫學工程和藥物開發中的關鍵步驟。在傳統的體外細胞培養中,細胞多為貼壁和二維生長,由于離體后的細胞失去了神經體液的調節和細胞之間的相互作用,而且處于相對靜止的環境中,所以細胞除了增殖外并沒有像在體內那樣發揮其作用,也不能真實反映其在體內的生存情況。微流控芯片和傳統的體外細胞培養相比,具有很多優點,諸如:精確控制物質濃度、溶液溫度和pH值等細胞微環境要素;提供微小和復雜的結構來模擬細胞在體內的生存環境;提供三維生長環境以模擬細胞在體內的狀態,考察細胞的行為(如基因表達、受體作用和其它生命活動)等。在哺乳動物組織中,細胞的生長受到多方面因素的影響,不僅細胞之間存在相互作用,細胞與胞外基質也有密切聯系,同時細胞還受到各種自分泌、旁分泌及激素等信號分子的作用。因此建立細胞體外三維培養環境,需要將細胞植入模擬細胞外基質的培養環境中。目前有天然和合成的水凝膠已被成功整合到芯片上,但與此同時也出現一些問題,如操作復雜和阻礙物質的傳輸。為解決這些問題,Ong等設計了橢圓形微柱陣列的芯片(圖1A)。細胞預先用高碘酸鈉處理,使其表面的糖蛋白產生醛基,再與培養液中的聚乙烯亞胺酰肼(polyethyleneimine-hydrazide)連接物結合形成三維生長結構,最后,用鈣黃綠素和碘化丙啶染色后,觀察細胞的生長情況。另外,Huang等設計了一款自動培養細胞的芯片(圖1B),通過設置氣動微泵和微閥使培養液和緩沖液流入細胞培養區域,同時將代謝廢物排出。芯片中的柵欄形微型加熱器和溫度感應器能提供一個較恒定的溫度(37?C±1?C)。羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液則為細胞生長提供適宜的pH條件。Nevill等設計制備微流控芯片,將細胞培養和電化學裂解功能結合在一起,對細胞中的蛋白(p53和HRP)進行分析,大大降低了分析時間和成本。在微流控芯片上還可以進行肝、肺細胞和組織培養,構建體外毒理實驗模型。除此之外,微流控芯片還可以用于干細胞和癌細胞的培養。由于干細胞生活在復雜的物理、化學和生物因素下,傳統的培養方法不能很好地模擬其生理環境,并受到各種限制,而微流控芯片技術可以更好地模擬干細胞在體內復雜的生活環境,以高通量和可變方式精確控制各種參數。癌細胞最大的特點是侵襲和轉移,利用微流控芯片可以模擬癌細胞滲入血管、在血管內隨血液循環流動、滲出血管和遷移到靶組織等一系列過程。由此可見,采用微流控芯片來培養細胞將成為細胞生物學研究的一個重要手段。

A:非水凝膠3D微流控細胞培養體系包括兩個入口(一個是培養基入口,另一個是細胞灌注入口)和一個出口。微壩結構將微流控通道分為中心細胞培養室和兩邊用來擴散培養基的通道兩部分;B:細胞自動培養體系圖解說明,此體系由一個細胞培養室,四個微泵、四個微閥、微通道、儲液池、兩個加熱器和一個微型溫度傳感器組成。

2.細胞分選

細胞分選是從非均一細胞體系中篩選出性質均一細胞的技術,在細胞免疫學和臨床診斷中具有非常重要的作用。目前最常用的細胞分選方法有磁珠免疫法和流式細胞儀法,其中磁珠免疫法對細胞表面有特異性要求,而流式細胞儀雖然能對細胞進行快速可靠的分選,但其體積龐大、價格昂貴、難以滅菌。除此之外還需要專業人員操作和復雜的前處理過程,并伴隨大量的樣本消耗。為了彌補這些缺陷,有報道將流式細胞儀的主要部件與微流控芯片結合起來,從而實現小型化和低成本分選細胞。

目前,以微流控芯片技術為平臺的細胞分選方法主要有兩種:

(1) 以微結構和層流為基礎的被動分選;

(2)以各種外力(如磁力、介電電泳力、電動力等)驅動的主動分選。

2.1以細胞大小為基礎的過濾分選

借助微型機電系統(MEMS)技術,Chen等設計和制造的立柱型和堤壩型過濾芯片,依靠平行的微立柱和微壩尺寸大小來分離細胞。圖2A所示的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片利用紅細胞與白細胞體積大小的差異將紅細胞從大鼠全血中分離出來,在主通道的垂直方向設置了微型堤壩,兩者存在5?m的高度差,當緩沖液沿垂直主通道方向灌流時,紅細胞被沖到側面,經過微型堤壩結構流入收集池里。圖2B所示芯片在主通道內兩側設計了兩排直徑20μm、間隔6.5μm的立柱,圓餅狀、體積較小的紅細胞能通過立柱間的縫隙進入兩邊的通道,而圓球狀的體積較大的白細胞則留在主通道內,從而達到分選效果,與此同時,連續流動的溶液將白細胞沖到出口處,避免微通道發生堵塞。

2.2受介電電泳作用的細胞分選

介電電泳是指本身不帶電、但可以發生不同程度極化的顆粒在非均勻的電場中移動的現象。與電泳分離不同,介電電泳不是依靠粒子的荷質比,而是依據不同介電性質對顆粒進行分離。當處于非均勻電場時,細胞產生極化現象,其表面會發生偶極矩作用,進而細胞在介電電泳力作用下,向高場強(正向介電電泳)或低場強(負向介電電泳)方向移動。由于細胞的大小、形狀、介電性質不同,細胞所受介電電泳力的大小和方向也不盡相同,因此可對細胞進行分選。

以微流控芯片介電電泳為基礎的分選技術具有很多優點:

(1) 所需技術成本低;

(2) 不需要對細胞表面進行修飾;

(3) 操作簡便;

(4) 特異性高等。

基于以上優點,在微流控芯片上進行介電電泳已被廣泛應用于細胞分選。Nascimento等利用芯片介電電泳對受寄生蟲侵染和未被侵染的紅細胞進行分選。當紅細胞受到侵染后,其細胞膜的結構和表面抗原會發生變化,細胞膜通透性提高,使兩種細胞在電場中受力大小和方向不同,導致運動方向發生改變,進而獲得分離。為了在芯片上實現介電電泳必須產生非均勻電場,如圖2C所示,X型的絕緣結構用于產生非均勻電場,通過改變電壓和液體流速,收集HeLa細胞。Pommer等在微流控芯片上設計了兩個非均勻電場,對樣品中的細胞進行串聯介電電泳分離,從全血樣品中獲得了純度為95%的血小板。

2.3光驅動的細胞分選

用光作用力進行細胞分選主要有熒光激發和光鑷兩種形式。熒光激發的細胞分選是將目標細胞預先進行熒光標記,經過檢測區域時目標細胞被識別,在激光束作用下使目標細胞進入選擇通道。Wang等在微流控芯片上以熒光激發的方式,將被綠色熒光蛋白基因轉染的HeLa細胞分選出來,如圖2D所示,當樣品流經檢測區域時,光電二極管檢測到細胞的存在,接著光電倍增管對細胞所發熒光進行分析,聲光調制器觸發光學開關將表達綠色熒光的HeLa細胞送入收集通道。光鑷是一種光效應,激光聚集可形成光阱,微小物體受光壓而被束縛在光阱處,移動光束使微小物體隨光阱移動,借此可在顯微鏡下對微小物體操控。如圖2E所示,在光鑷芯片上,細胞樣本被數字成像系統檢測、識別、追蹤,以產生的可控信號為基礎,利用激光光鑷,目標細胞自動轉入鄰近的鞘流,最終被分流到下游收集區域。

2.4磁性細胞分選

磁性分選在芯片細胞分選中尤其受歡迎,因為磁力對細胞活力的影響最小。磁性細胞分選的原理是:在目標細胞表面包裹磁性微粒[38]或將磁性納米顆粒引入細胞內部,從而使其帶上磁性標簽,當帶有磁性標簽的細胞流經磁場區域時,磁力使目的細胞偏離原來的運動軌道。由于不同細胞的大小、磁化率、流速不同,細胞偏離原來層流方向的程度不同,從而將細胞分選出來。微流控芯片上的磁性細胞分選可以實現對兩種及多種細胞的分選,可以將待分選的細胞用磁性標簽標記,其余細胞不做標記,當目標細胞流經磁場區域時運動方向發生改變,從而被分離出來;也可以將多種細胞施加不同磁性標簽以達到分選目的。Adams等就在微流控芯片連續層流基礎上實現了同時對多種細胞進行空間定位分選,如圖2F所示,細胞在進樣之前用不同磁性標簽標記,流經磁場區域時,不同細胞在磁力和流體驅動力的合力作用下流向不同的收集通道,最后在收集通道將細胞用洗脫液洗脫出來,從而達到細胞分選的目的。

A:用于分選血細胞的PMMA微流控芯片。左圖為微流控芯片整體示意圖,共有7個口,1:注血口;2-4:緩沖液注入口;5,6:紅細胞收集口;7:廢液口。右圖為分選區域局部放大圖;B:用于分選細胞的連續流動微流控芯片。左圖為立柱型分選血細胞芯片概略圖,a:血液樣品注入口,b:白細胞收集口;c:紅細胞和血漿收集口;右圖為裝置末端微立柱陣列掃描電鏡圖;C:負向介電電泳分離HeLa細胞的微流控芯片;D:熒光激發的微流控芯片細胞分選示意圖,細胞流經中心通道時,經過分析轉換,靶細胞流向收集口,而其他細胞流入廢液口;E:自動化細胞分選系統設計圖。當細胞通過興趣區時,數字圖像處理系統產生信號,激發激光光鑷,將目的細胞從樣品中分離出來;F:多靶標磁性細胞分選結構。樣品中含有過量的非目標細胞和2個不同的靶細胞(目標1和目標2),靶細胞分別用特定標簽(標簽1和標簽2)標記,細胞在MFS1和MFS2產生高梯度磁場區域發生分離

微流控芯片技術自20世紀90年代出現以后,隨著生物、材料、化學、物理工程和電子工程等學科的介入,目前已取得了巨大的發展,其最終目的是建立多功能芯片實驗室。微流控芯片技術正以其獨特的優勢越來越多地應用到細胞生物學研究中,其不僅可以為細胞提供可控制的生存微環境,與其他分析方法結合檢測細胞內生化過程,而且在細胞個體、細胞群體和多細胞生命體三個層次對細胞的生命活動進行深入研究。另一方面,微流控芯片仍處于發展初期,許多方面的技術還不成熟,如不能進行長期細胞培養;細胞三維培養中一些水凝膠和粘連蛋白的引入可能阻塞通道和妨礙物質傳輸;電裂解細胞時產生的焦耳熱和氣泡會影響細胞生長和代謝等。目前微流控芯片大多處于實驗室概念化論證階段,尚未達到理想的商業化和通用化程度;對微流控芯片技術了解不多的生物研究人員,應用起來還有一定的困難。但是,基于微流控芯片的突出優點和人們對新技術的需求,我們相信微流控芯片細胞實驗室將成為細胞生物學研究的重要平臺。

（文章節選自：微流控芯片技術在細胞生物學研究中的應用進展 作者：姚　琳　白亮　吳亮其　丁永勝* 科學網科學網轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）