細(xì)胞的復(fù)蘇及凍存的方法
一. 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
將液氮或- 80℃ 保存的腫瘤細(xì)胞于 37℃ 水浴，快速溶化，用 8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液，于 1500 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘。 棄上清，再吸取 8.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀，再 1500 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用 1.0ml 培養(yǎng)基混勻，備用。 另取一個(gè) 75cm2 方瓶，加入 14.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)，將上述制備的含 腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中，于 37℃，5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。
若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，大約 3－4 天細(xì)胞基質(zhì)會(huì)變黃，5.0ml 細(xì)胞懸液可傳代一個(gè)方瓶培養(yǎng)，可用 3－4 個(gè)方瓶培養(yǎng)，一個(gè)方瓶中呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞可達(dá) 1-1.5×107 個(gè)，根據(jù)試驗(yàn)所需，可決定傳代的次數(shù)。 若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生 長(zhǎng)，經(jīng)過 3-4 天，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%-95% 單層時(shí)，棄上清，用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml)，處理腫瘤細(xì)胞大約 3-5 分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng) 90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí)，即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中，于 1500 轉(zhuǎn)/ 分下，離心 3 分鐘，棄上清，加少許培養(yǎng)基混勻，可傳代 3 個(gè) 75cm2 方瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
二. 細(xì)胞凍存
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞用 1 個(gè) 75cm2 方瓶按上述方法收集，于 1500 轉(zhuǎn)/分離心 3 分鐘，棄上清，用保種液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻，分別加入到 2-3 只保種管中，寫上腫瘤細(xì)胞名稱、時(shí)間、保種者姓名，放- 80℃ 保存，次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存( 注： -80℃ 下可保存細(xì)胞半年至一年，液氮可保存細(xì) 胞 5-10 年，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌 ( 121℃，30 分鐘) ，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)除菌，所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù)，避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
將液氮或- 80℃ 保存的腫瘤細(xì)胞于 37℃ 水浴，快速溶化，用 8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液，于 1500 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘。 棄上清，再吸取 8.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀，再 1500 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用 1.0ml 培養(yǎng)基混勻，備用。 另取一個(gè) 75cm2 方瓶，加入 14.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)，將上述制備的含 腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中，于 37℃，5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。
若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，大約 3－4 天細(xì)胞基質(zhì)會(huì)變黃，5.0ml 細(xì)胞懸液可傳代一個(gè)方瓶培養(yǎng)，可用 3－4 個(gè)方瓶培養(yǎng)，一個(gè)方瓶中呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞可達(dá) 1-1.5×107 個(gè)，根據(jù)試驗(yàn)所需，可決定傳代的次數(shù)。 若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生 長(zhǎng)，經(jīng)過 3-4 天，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至 80%-95% 單層時(shí)，棄上清，用 0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml)，處理腫瘤細(xì)胞大約 3-5 分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng) 90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí)，即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中，于 1500 轉(zhuǎn)/ 分下，離心 3 分鐘，棄上清，加少許培養(yǎng)基混勻，可傳代 3 個(gè) 75cm2 方瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
二. 細(xì)胞凍存
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞用 1 個(gè) 75cm2 方瓶按上述方法收集，于 1500 轉(zhuǎn)/分離心 3 分鐘，棄上清，用保種液( 含 10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻，分別加入到 2-3 只保種管中，寫上腫瘤細(xì)胞名稱、時(shí)間、保種者姓名，放- 80℃ 保存，次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存( 注： -80℃ 下可保存細(xì)胞半年至一年，液氮可保存細(xì) 胞 5-10 年，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌 ( 121℃，30 分鐘) ，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)除菌，所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù)，避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
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