秀麗隱桿線蟲通常縮寫為  線蟲， 是一種非寄生線蟲，由于其特殊的屬性，它被廣泛用作生物學中的模式生物。線蟲的神經系統一直是科研工作者調查的主題，因為它是最簡單的有機體之一。這種興趣使  秀麗隱桿線蟲  成為第一個將其全基因組測序的多細胞生物體。這些特點使  C. elegans  成為生物學家在活細胞成像領域的選擇。

為了實現秀麗隱桿線蟲的高分辨率，活細胞視頻和圖像而實現的最重要的先決條件 是動物的固定化。事實上，偶然運動可能會引起文失焦圖像，使整個觀察無用。固定化方法可以分為兩種通用方法：化學技術和物理技術。

第一類包括通過任何化學化合物（如金屬離子或抗體）實現固定的所有方法。雖然這些技術可以在固定化方面提供良好的結果，但它們中的大多數似乎對細胞有不利影響，即使使用非常低的濃度。另一方面，物理技術通常取決于介質的粘度通過捕捉和保持蝸桿的某些方式或一些手段來改變。在Aufderheide（2008）中可以找到更詳細和詳盡的這些方法的綜述。

關于  秀麗隱桿線蟲，在文獻中蠕蟲固定的最常用技術依賴于使用膠水或麻醉藥物。雖然這些方法已經很成熟，但它們可能會影響樣本誘導生理變化或阻止未來的操作。此外，它們是低通量技術，因為用這些方法固定大量線蟲相當困難和耗時。即使使用更新和更復雜的手段來獲得  線蟲 固定化，如聚苯乙烯納米粒子（Kim  et al。，2013），而設置起來更容易有缺陷。最嚴重的缺點是，固定化依賴于蠕蟲生長階段，因此需要預測蠕蟲的種群。

微流控技術 可以解決與線蟲研究有關的固定化和其他問題 ，因為它不僅可以控制流體流動和藥物輸送  到樣本，還可以為動物易于操作和處理提供平臺。此外，避免使用膠水和麻醉劑進行需要蠕蟲固定的研究。

近年來，為了獲得片上蠕蟲固定，已經開發了許多微流控中的方法和裝置。最顯著的是通過冷卻（K. Chung  et al。，2008），壓縮或限制（TV Chokshi  等人，2009; SE Hulme  等人，2007），CO2（TV Chokshi  等人，2009）和周圍流體的凝膠化（J.Krajniak和Lu，2010）。

1.微流控溫度誘導 秀麗隱桿線蟲的固定

Kwanghun Chung（K. Chung 等，2008）開發的這種方法  解決了體內  顯微鏡，表型和篩選的關鍵挑戰  ，即具有能夠以與標準讀數兼容的方式處理蠕蟲的硬件，并且允許自動化觀察和操作樣品。在這項技術中，它采用了 內置閥門的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片控制線蟲的懸浮。該設備的關鍵特征在于集成了幾項關鍵設計特性，確保實驗具有高通量。另外，可以采用一種算法來自動完成圖像采集，分析和分類的整個過程，從而使系統無需人工干預即可運行。Chung的方案依靠4個步驟（圖1）：蠕蟲首先通過恒定的壓力驅動流動（恒壓泵）加載到微流體裝置中，然后通過冷卻可逆地固定樣品，并由高分辨率顯微鏡掃描。隨后，進行表型分型并將獲得的視頻/圖像存儲用于進一步分析。

所述微流控芯片  是通過常規的軟光刻方法制造。它由兩層組成，一個用于流量調節，一個用于溫度控制，由一個20μm厚的PDMS膜分開（圖2）。這些層通過等離子體處理結合在一起并覆蓋玻璃板。微流體裝置的特征在于六個顯著特征：

圖2

1.  內置系統可自動調節芯片內的線蟲負載，確保成像室內一次只有一個蠕蟲。

2.  一個定位系統，可以高精度地將每只動物放置在同一個位置。

3.  溫度控制系統，其提供所需的樣品的固定的冷卻。

4.  裝置與任何標準顯微鏡設備完全兼容。

5.  低成本和相對容易的制造。

6.  高吞吐量和分揀效率。

為了將蠕蟲加載到芯片中，兩個出口通道都關閉，而側面定位通道保持打開。然后通過恒壓泵將流體驅入通道。此外，加載調節器系統確保一次只有一個蠕蟲在指定用于成像的芯片區域中。這是可能的，因為當動物存在于成像室中時，室的流動阻力增加。流量壓力 - 降低位于成像室入口處的樣品加載調節器上的第二只動物的壓力。因此，這種壓降使系統無法將第二個蝸桿推入其中。然后，當第一個蠕蟲被釋放時，這個限制被解除，并且壓力回升到系統能夠推動連續蠕蟲內部的點。為了實現成像室內精確和可重現的定位，利用定位通道與主通道入口之間的壓力差。事實上，一旦動物定位在檢測區域內，定位通道的流體動力學阻力就自動均衡，并且因此壓力均勻地分布在蝸桿的主體上，防止對動物造成過高的機械壓力。該系統的高精度放置功能可以最大限度地減少顯微鏡電動載物臺的移動距離，從而確定蠕蟲的位置，從而使整個過程更加省時。一旦放入成像區域，線蟲被冷卻至?4°C以固定它們。該程序不使用任何麻醉劑，因此不會因藥物使用而對樣品產生任何潛在的副作用。此外，已被證明與疊氮化鈉固定效果相同。最后，使用微流控技術可以使該設置輕松便宜地進行復制，并與任何標準顯微鏡設置完全兼容。

2.  線蟲 在微流控芯片上的二氧化碳固定化

TVChokshi  等。 （2009）開發了一種線蟲 技術 它利用微流體芯片的優勢，內置固定室，蝸桿通過創建CO2微環境而被捕獲。事實上，二氧化碳能夠長時間抑制線蟲的運動（長達2小時），而不會對蠕蟲造成任何永久性損害，確實在固定后可以恢復幾秒鐘。此外，這種方法已被證明適用于不同年齡組的蠕蟲（L4）。使用的裝置是一個雙層PDMS微流控芯片（圖3）：一層稱為“行為”模塊，被固定化后的動物恢復活力，另一層為蠕蟲被固定的位置，因此被命名為固定化模塊。行為模塊由一個鋸狀微通道組成，這個通道迫使蠕蟲以正弦形式移動，以便進一步分析它的運動。固定層含有產生二氧化碳微環境的腔室以固定蝸桿，從而可以進行成像。最后，這兩層由30微米厚的隔離層PDMS膜。二氧化碳微環境是通過使純二氧化碳通過控制層并通過膜擴散進入流動層而獲得的。眾所周知，PDMS對非極性氣體具有高度滲透性，因此二氧化碳能夠快速替換固定室中的空氣。此外，隔膜足夠厚以能夠維持氣體壓力（10psi）而沒有明顯的偏轉。

圖3

蠕蟲被裝入芯片的主要流動通道并通過激活集成的微流體閥來操縱（圖3中的閥門1,2和3）通過控制通道。垂直于主加載通道的單獨通道（“位置”通道）用于將蠕蟲定位在行為模塊和固定模塊內。為了防止蝸桿進入位置通道，一些PDMS支柱（圖3，II）在與裝載通道的交叉處制造。這種技術可以實現長時間的固定（長達2小時），從而允許更長的時間進行顯微鏡觀察。此外，固定室內氧氣的缺乏減少了熒光標記物的光漂白，使得CO 2方法對于長期熒光成像實驗（例如細胞發育的延時成像）特別有吸引力。

3. 用于 線蟲 誘捕的微流控陣列夾具

S. Elizabeth Hulme  et al。 （2007）設計了一種微流體裝置，能夠 一次性機械地捕捉大（> 100）數量的  線蟲。該程序依賴于在楔形通道（圖4）的微流體芯片或“夾子”中的實施，其能夠捕獲蠕蟲并由此物理地抑制其運動。具體而言，微通道的寬度逐漸變窄，從100μm降至10μm，長度為5mm（圖4）

圖4

該裝置本身由一個分配通道網絡組成，該分配通道通過驅動動物的恒定壓力流動來提供這些夾具的陣列。由于在沒有藥物治療或任何其他潛在傷害性措施的情況下進行固定，該方法不會干擾蠕蟲的天然生化狀態。此外，通過逆轉流動的方向，蠕蟲從陷阱中釋放出來，因此可以對同一群體進行重復采樣。 芯片的入口和出口之間需要有恒定的壓差才能將蠕蟲驅動并捕獲到夾具中。必須強調的是一個恒定的壓力，重要的是  不 在這種情況下需要一個恒定的流量，因為恒定流動狀態導致的壓力的無限增加會對固定蠕蟲造成嚴重的機械損傷。圖5顯示了微流體裝置的示意圖，該裝置基本上由一系列單獨的蝸桿夾具組成。通道被設計成可以逐漸卷繞，因此可以適應不同大小的蠕蟲，因為即使在同基因群體中，也可以發現個體之間明顯的尺寸差異。因此，該系統還可以作為分析設備來測量給定蠕蟲種群的大小分布。此外，已經選擇了高階分枝拓撲的分叉，以避免蠕蟲在芯片內分布的任何偏差。最后，由于被困蠕蟲增加了給定通道的流體阻力，當另一個蠕蟲到達同一交叉點時，它不會沿著同一條路徑行進; 因此該裝置被設計為僅用一個蝸桿加載給定的夾具。但是，重要的是要注意，當蠕蟲被固定時，即不能控制蠕蟲的方向，也就是說，如果它被頭先捕獲或尾先捕獲。

圖5

總結起來，這項技術在相當短的時間內（約15分鐘）可以在沒有任何化學化合物的情況下可逆地固定大量的線蟲。這可以幫助研究人員在實驗過程中節省大量時間，并確保在所有觀察時間內都能獲得高通量。此外，使用微流體裝置留下了可能被捕獲的線蟲數量進一步改善的可能性，并且還實施了添加其他微流體組分的新特征，例如用于藥物注射。最后，由于固定裝置產生有序蠕蟲的陣列，原則上應該可以使用電動顯微鏡臺自動獲取數據。

4.  線蟲 在微流控芯片上的壓縮固定

該技術由Trushal V. Chokshi（TV Chokshi  等，2009）開發，它是前面描述的二氧化碳方法的變體。事實上，該設備的設計幾乎完全相同 - 一個雙層PDMS芯片 - 唯一的區別在于分隔兩層的隔膜。事實上，這次動物的固定是機械地實現的：高壓（25psi）的空氣流動導致膜在蝸桿上偏轉并壓縮蝸桿，從而抑制蝸桿的運動（圖6）。

圖6

為了使固定的效果最大化，進行一些改變以使膜更易變形。首先，使用20：1的PDMS /固化劑混合比率而不是常規的10：1; 這使得PDMS彈性模量減少了兩倍。此外，固定模塊中微通道的寬度比鋸狀微通道（90μm）的寬度更寬（110μm），以允許較大的膜偏轉。該方法的優點在于制造微流體裝置的容易性及其進一步的實施。此外，該技術適用于不同年齡的動物，并且可以以串行方式應用于大量蠕蟲以增加吞吐量。

5. 線蟲 固定在芯片-凝膠雜化微流體裝置

前面描述的方法對于形態學和表型調查是非常有效的，但是存在一些缺點。事實上，它們不允許縱向研究生理活性過程（例如冷卻方法）或者由于固定它們所使用的壓縮而引起蠕蟲解剖特征的變化（例如，夾具和壓縮方法）。Jan Krajniak和Hang Lu（2010）針對這些問題設計了一種混合型微流控芯片 - 凝膠系統，該系統可以在生理條件下對特定開發過程進行長期高分辨率成像。特別是該設備能夠一次培養，固定和成像線蟲。C.線蟲的可逆固定化 通過使用生物相容性聚合物：Pluronic F127（PF127）來實現。事實上，這種聚合物能夠進行可逆的溶膠 - 凝膠轉變，可以通過小的溫度變化（?2°C）進行熱誘導。特別是，當PF127處于其凝膠狀態（凝膠化）時，其粘度增加的水平會抑制動物的任何運動。所采用的微流體裝置是基于PDMS的雙層芯片（圖7），其中兩層由薄PDMS膜分開。

圖7

一個模塊用于加載和流量控制，另一個用于溫度控制。兩個通道的厚度均為3 mm，而它們之間的隔膜為30μm。芯片的兩層用傳統的氧等離子體處理結合在一起。該裝置的一個關鍵特征是蠕蟲在該裝置內培養，因為后者能夠為其8個室內的線蟲提供營養和氣體交換（圖8）。

圖7

此外，這些室用于在所有調查時間內保持動物分離，從而確保可以在單一動物的基礎上進行發育。流層包含所有流入口，這些入口用于加載蠕蟲并向腔室供應PF127溶液和各個培養室。此外，使用氣動閥門以防止線蟲從培養室逃逸。第二層是溫度控制模塊，它用于在設備上產生小的（幾°C）溫度變化以觸發PF127轉換。通過調節流量來實現精確的溫度控制的加熱流體并保持加熱流體源溫度。如前所述，所采用的固定機制依賴于PF127的溶液，PF127被導入培養室并進入由熱轉變觸發的可逆溶膠 - 凝膠轉變。因此固定在室內的任何地方進行，不依賴于蝸桿布置，并且具有最小的環境變化。總之，該方法能夠長時間固定多達8個蠕蟲而不干擾其生物學功能，此外，固定方案在完全可逆的情況下可以達到不確定的次數。

結論

  在這篇文章中，已經提出了一些實現C. elegans 固定的最顯著的微流控方法  。特別強調了利用微流控技術實現這一目標的明顯優勢。常規固定方法主要依賴于膠水或麻醉藥物，已被證明是耗時，低通量且對樣品有害的。現在出現的明顯問題是：  我應該選擇哪種微流控技術？

這個問題沒有特定的答案，哪種技術最適合你，這取決于你的要求和需求。此外，這些方法中的每一種在線蟲  固定化方面確保非常好的結果  。無論如何，其中Chokshi的方法提供了最佳的折中方面的制造困難表現。所采用的微流控裝置實際上相當簡單，因為它是一個雙層PDMS芯片與一個簡單的通道陣列。此外，如果研究人員要求短時間（分鐘）或長時間（小時）固定時間，則可以使用相同的設計用于兩種固定技術（壓縮和CO2）。此外，這種方法可以應用于不同年齡組的蠕蟲，并允許動物完全恢復固定。

Tips:汶顥提供PDMS微流控芯片及夾具、恒壓泵、注射泵等相關產品及技術服務。