癌癥的精準(zhǔn)診療是提高癌癥患者生存率和生存質(zhì)量的重要手段。液體活檢通過(guò)采用非侵入采樣方式, 獲取腫瘤病人全面、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組等生物學(xué)信息, 是一種新興的癌癥診斷技術(shù), 對(duì)癌癥精確診斷、個(gè)體化治療、預(yù)后評(píng)估等方面具有重要意義。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是一種從實(shí)體瘤組織脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞, 因能提供完整的細(xì)胞生物學(xué)信息, 是最具應(yīng)用前景的液體活檢靶標(biāo)。然而, CTC的數(shù)量極其稀少、異質(zhì)性強(qiáng)、所處外周血環(huán)境復(fù)雜等特點(diǎn), 給CTC的富集和分析帶來(lái)了巨大的技術(shù)挑戰(zhàn)。

上海交通大學(xué)楊朝勇教授總結(jié)其課題組近年來(lái)發(fā)展的基于CTC液體活檢策略, 著重討論在CTC識(shí)別、富集與單細(xì)胞分析等方面的研究進(jìn)展。相關(guān)專(zhuān)題論述在線發(fā)表于《中國(guó)科學(xué)：化學(xué)》中文刊。

癌癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生存健康, 是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的第二大病因。據(jù)統(tǒng)計(jì), 2015年全球約有1750萬(wàn)新發(fā)的癌癥患者, 870萬(wàn)例死亡與癌癥相關(guān)。癌癥的早期篩查、精確診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)是提高癌癥患者生活質(zhì)量及生存率的重要手段。作為腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn), 組織活檢存在取樣難、侵入性大、代表性不全、并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)高等不足。

近年來(lái), 針對(duì)體液(血液、尿液、胸腔積液等)中的生物標(biāo)志物包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)、循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA)、外泌體(exosome)等的檢測(cè)技術(shù), 即液體活檢, 被認(rèn)為是癌癥體外檢測(cè)的重要發(fā)展方向。

與經(jīng)典組織活檢相比, 液體活檢技術(shù)具有取樣方便、侵入性小、信息全面、無(wú)放射性污染、成本低等優(yōu)勢(shì), 是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無(wú)創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)手段之一, 已成為當(dāng)前癌癥診斷領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。CTC是從實(shí)體瘤組織脫落進(jìn)入外周血的、完整的腫瘤細(xì)胞, 與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān); ctDNA是由腫瘤細(xì)胞凋亡釋放在外周血中的游離DNA片段, 并攜帶腫瘤相關(guān)的遺傳學(xué)突變, 能夠反應(yīng)腫瘤組織的突變圖譜, 是早期篩查、預(yù)后評(píng)估的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo); 外泌體是存在于體內(nèi)的細(xì)胞外囊泡, 包含有腫瘤細(xì)胞相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)等, 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息遞送, 近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)外泌體是腫瘤檢測(cè)的重要靶標(biāo)之一。

相比于碎片化的ctDNA片段和納米尺度的外泌體, CTC由于其完整的細(xì)胞性質(zhì), 不僅能夠提供腫瘤病灶的基因組變異、mRNA表達(dá)異常、蛋白質(zhì)組變化等物質(zhì)信息改變, 還能從細(xì)胞形態(tài)、遷徙能力、藥物刺激響應(yīng)研究等方面對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制進(jìn)行研究, 能全面、系統(tǒng)地反映腫瘤病灶的分子病理分型, 因此尤為受到關(guān)注。大量研究證明, CTC的檢測(cè)分析在腫瘤診斷、病程監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估、藥物開(kāi)發(fā)、個(gè)體化治療等方面具有重大意義。

CTC早在1869年就被Ashworth等發(fā)現(xiàn)報(bào)道, 但直到20世紀(jì)90年代中期, CTC相關(guān)研究報(bào)道才逐漸增多, 主要原因在于CTC的檢測(cè)分析存在較多技術(shù)挑戰(zhàn)。首先, CTC數(shù)量極少, 通常1mL外周血中僅含有1~100個(gè)CTC, 而血細(xì)胞的數(shù)量數(shù)以億計(jì)。在如此龐大復(fù)雜的背景細(xì)胞下, 很難實(shí)現(xiàn)CTC的高靈敏檢測(cè)。因此, 發(fā)展高效的富集方法是CTC檢測(cè)分析的關(guān)鍵步驟和重要前提。

目前主要有兩類(lèi)富集方法, 第一類(lèi)是基于CTC和血細(xì)胞尺寸、密度、介電性等物理特性差異, 通過(guò)微過(guò)濾、離心、介電泳等方法實(shí)現(xiàn)CTC的富集。但這類(lèi)方法存在特異性差、純度低等不足。另一類(lèi)是基于CTC和血細(xì)胞表面標(biāo)志物差異, 利用識(shí)別分子修飾的磁珠或微納芯片親和富集CTC。這類(lèi)方法具有特異性強(qiáng)、純度高等優(yōu)點(diǎn), 是目前最常用的CTC富集策略。但CTC存在不同的亞群, 無(wú)通用標(biāo)志物; 且有些CTC會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT), 其標(biāo)志物表達(dá)水平處于動(dòng)態(tài)變化中。目前通常采用的上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體親和富集CTC的方法, 會(huì)“漏檢”EpCAM低/不表達(dá)的CTC, 也難以實(shí)現(xiàn)CTC的分型捕獲。因此, 發(fā)展高效、特異的新型識(shí)別分子, 實(shí)現(xiàn)CTC富集和分型分析具有重要的意義。

腫瘤組織內(nèi)和腫瘤組織間都存在異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞, 來(lái)源于實(shí)體瘤CTC同樣存在較強(qiáng)的異質(zhì)性。研究表明, 只有少數(shù)CTC具有轉(zhuǎn)移能力及腫瘤耐藥性突變等。傳統(tǒng)以細(xì)胞群體為對(duì)象的分析方法, 容易掩蓋細(xì)胞-細(xì)胞之間微小的差異, 難以實(shí)現(xiàn)CTC腫瘤異質(zhì)性的研究。因此, 單細(xì)胞水平的CTC組學(xué)研究具有重要的意義。為實(shí)現(xiàn)CTC的單細(xì)胞分析, 需要解決兩個(gè)技術(shù)難題: (1) 對(duì)富集捕獲的CTC實(shí)現(xiàn)無(wú)損釋放, 方便下游培養(yǎng)及表征分析, 獲得CTC的真實(shí)生物學(xué)信息; (2) 建立高通量單細(xì)胞分析平臺(tái), 精準(zhǔn)地挖掘CTC與正常細(xì)胞、CTC之間的異質(zhì)性, 檢測(cè)CTC的組學(xué)變化, 進(jìn)而推動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究及個(gè)體化治療的發(fā)展。

微流控技術(shù)是在微米級(jí)通道內(nèi)進(jìn)行流體控制以實(shí)現(xiàn)微量的生物、化學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的新興技術(shù)。基于微型化、自動(dòng)化、集成度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn), 微流控技術(shù)在CTC分離富集和單細(xì)胞分析中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)微通道、腔體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì), 能夠針對(duì)CTC的物理、生化性質(zhì)實(shí)現(xiàn)特異性分離與富集。另一方面, 通過(guò)微孔、卡槽、微液滴等單細(xì)胞分散手段的組合, 實(shí)現(xiàn)對(duì)捕獲的CTC進(jìn)行高通量分散操控, 并提供納升到皮升的反應(yīng)空間, 達(dá)到對(duì)CTC的高效精準(zhǔn)單細(xì)胞分析, 是極具前景的分離分析技術(shù)。

針對(duì)基于CTC液體活檢的發(fā)展和臨床應(yīng)用需求, 上海交通大學(xué)楊朝勇課題組從發(fā)展新型高親和力的識(shí)別分子、建立高效富集CTC的微流控平臺(tái)、構(gòu)筑高通量的單細(xì)胞分析方法三個(gè)層面解決目前CTC測(cè)不準(zhǔn)、數(shù)不全的難題和單細(xì)胞檢測(cè)分析的需求。近期發(fā)表于《中國(guó)科學(xué)：化學(xué)》的文章總結(jié)了在核酸適體篩選新策略、CTC高效富集方法及高通量單細(xì)胞分析方法的研究進(jìn)展。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析過(guò)程示意圖

CTC作為液體活檢技術(shù)中的重要靶標(biāo), 已被美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)推薦為腫瘤標(biāo)志物, 可作為腫瘤TNM分期的重要補(bǔ)充。外周血中CTC的個(gè)數(shù)和生物學(xué)信息與實(shí)體瘤組織存在一定的量效關(guān)系, 因此, CTC個(gè)數(shù)檢測(cè)及組學(xué)信息分析對(duì)腫瘤診斷、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估、個(gè)體化治療的臨床應(yīng)用及腫瘤轉(zhuǎn)移及抗藥性等機(jī)制的研究具有重大意義。然而, 由于其個(gè)數(shù)少、異質(zhì)性強(qiáng), CTC檢測(cè)分析仍存在巨大的挑戰(zhàn)。首先需要選擇高通量、高效率的CTC分離富集方法。以免疫識(shí)別為核心的富集手段, 雖能實(shí)現(xiàn)高效、高純度的CTC富集, 但是依賴標(biāo)志物表達(dá)的分離方法容易漏掉低表達(dá)/不表達(dá)的CTC, 而這些CTC往往是侵襲能力的亞群。此外, 免疫識(shí)別過(guò)程需要考慮到識(shí)別分子與細(xì)胞之間的作用力, 限制了微通道中的流體速度進(jìn)而限制了芯片的通量, 另外, 以細(xì)胞物理性質(zhì)差異實(shí)現(xiàn)CTC富集的物理分離方法, 雖可以規(guī)避免疫識(shí)別過(guò)程, 提高通量。然而物理分離方法, 一般純度較低、丟失率較高, 容易漏掉與血細(xì)胞有尺寸重疊的CTC亞群, 限制了其臨床應(yīng)用。因此, 結(jié)合多種原理, 實(shí)現(xiàn)CTC分離富集, 將會(huì)是未來(lái)CTC分離技術(shù)發(fā)展的核心思路。

核酸適體作為高特異、高親合力的識(shí)別分子, 雖可通過(guò)體外篩選技術(shù)獲得任何腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)的識(shí)別分子, 但大量研究表明, 核酸適體在外周血環(huán)境中, 容易受到核酸酶、緩沖環(huán)境等干擾, 使其穩(wěn)定性和結(jié)合力受到影響。因此, 以外周血等復(fù)雜基質(zhì)為篩選條件的核酸適體篩選方法的開(kāi)發(fā), 將會(huì)大大擴(kuò)展核酸適體分子在CTC識(shí)別富集中的應(yīng)用。此外, 利用納米材料、聚合物等提高核酸適體的穩(wěn)定性, 構(gòu)建核酸適體多價(jià)效應(yīng)等方式, 也將大大提高現(xiàn)有核酸適體的使用范圍。

CTC的數(shù)目雖能做為腫瘤分期的補(bǔ)充, 但是CTC本身攜帶的組學(xué)信息更具有研究意義。要實(shí)現(xiàn)CTC的下游分析, 首先需要實(shí)現(xiàn)CTC的無(wú)損釋放。已經(jīng)有不少課題組開(kāi)發(fā)了CTC的釋放方法, 如溫度響應(yīng)、核酸酶水解、光切割。這些方法雖在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中展示了>95%的釋放效率, 但是在臨床樣本體系, 仍存在釋放效率低、損失率高等問(wèn)題。因此, 亟需發(fā)展適用于臨床應(yīng)用的CTC釋放方法。

CTC單細(xì)胞分析技術(shù)是CTC研究的重點(diǎn)方向。CTC單細(xì)胞測(cè)序方法可以比較CTC與原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳組的差異, 為認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制提供全新的視角。例如, 2017年, Gao等對(duì)一位結(jié)腸癌患者的CTC、原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析, 發(fā)現(xiàn)CTC拷貝數(shù)變異(CNV)存在較大的異質(zhì)性, 揭示了可能只有部分腫瘤細(xì)胞可能形成轉(zhuǎn)移灶。因此, 單細(xì)胞全基因組測(cè)序提供了從根源上分析原發(fā)灶、CTC、轉(zhuǎn)移灶的遺傳變異的手段, 揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的可能性。

其次, 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表觀遺傳學(xué)分析技術(shù)也處于蓬勃發(fā)展的狀態(tài)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展解決了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣品量少而難以檢測(cè)的問(wèn)題, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序。特別是以液滴微流控技術(shù)和編碼技術(shù)為基礎(chǔ)的Drop-seq和inDrop技術(shù)發(fā)展, 使得快速、便宜、高通量的單細(xì)胞RNA測(cè)序成為了可能。基于液滴微流控的商用高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分型、干細(xì)胞增殖與分化、腫瘤異質(zhì)性研究、腦/神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫異常研究等領(lǐng)域。隨著CTC富集技術(shù)的發(fā)展, 高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)必將在CTC領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用。

張惠敏, 吳玲玲, 林冰倩, 王奕迪, 畢云鵬, 王煒, 宋彥齡, 楊朝勇. 基于微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析研究進(jìn)展. 中國(guó)科學(xué)：化學(xué), 2019

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