大家好！為大家介紹一篇 2020 年發(fā)表在PNAS的文章，題目為 “A rapid and label-free platform for virus capture and identification from clinical samples” 。文章由The Pennsylvania State University的Mauricio Terrones課題組和New York University的Elodie Ghedin課題組合作完成。文章介紹了一種含有碳納米管陣列的微流控芯片，根據(jù)尺寸的物理參數(shù)，在3分鐘內(nèi)實現(xiàn)樣品中病毒分離，并對其進行快速分析、鑒定，準(zhǔn)確率可以達到90%。該平臺不僅可以進行快速病毒樣本分析，富集后的病毒樣品還可以回收并進行下游分析。Mauricio Terrones課題組的研究方向是多維度碳納米材料的開發(fā)應(yīng)用，及納米器件的設(shè)計開發(fā)，課題組網(wǎng)頁是https://sites.psu.edu/terronesresearch/；Elodie Ghedin課題組的研究方向是利用基因組學(xué)、分子病毒學(xué)和計算生物學(xué)的工具定義人類寄生蟲和其他病原體的基因組特征，課題組網(wǎng)頁是https://wp.nyu.edu/ghedinlab/。

[背景]

病毒種類多樣且進化速度迅速，目前有上百萬種未知病毒具有潛在的傳染人類的風(fēng)險。因此迅速查找并確認病毒種類成為控制傳染病以及傳染病學(xué)中重要的一環(huán)。在傳播的早期，發(fā)現(xiàn)和純化相應(yīng)病毒是控制傳染的第一步。現(xiàn)有技術(shù)的突破主要是通過新一代的快速測序技術(shù)等基因工具來對分離或者培養(yǎng)后的病毒進行檢測，用以確定病毒種類。然而漫長的培養(yǎng)不僅引入病毒變異的可能，也浪費了寶貴的時間，對于病毒進行快速有效的監(jiān)控具有一定挑戰(zhàn)性。

[VIRRION 平臺]

作者開發(fā)了一套完整的高通量樣本制備平臺，結(jié)合碳納米材料、微流控芯片及快速拉曼光譜儀，用于快速進行多種病毒的富集和無標(biāo)簽化檢測。該平臺命名為VIRRION（virus capture with rapid Raman spectroscopy detection and identification）。相比于之前他們的工作中1 mL/h的通量（見引用鏈接），VIRRION體系具有更高的通量，以滿足臨床樣本的需求。

圖1 VIRRION平臺內(nèi)部具有精準(zhǔn)可控的碳納米管陣列結(jié)構(gòu)，用于通過尺寸捕獲樣品中的病毒。毫米級的芯片通道可以保證在處理樣品時具有足夠的通量

        VIRRION平臺的設(shè)計采用微米、納米兩個尺度上的富集方法。首先，利用魚骨型陣列構(gòu)建微米尺度的湍流系統(tǒng)，實現(xiàn)微通道內(nèi)高效的液體混合效率；其次，以可控的氮摻雜碳納米管陣列參雜金納米粒子實現(xiàn)魚骨型通道的組裝，在病毒尺度上實現(xiàn)不同病毒顆粒的富集及無標(biāo)記拉曼檢測（摻雜金納米粒子，以增強拉曼信號）；利用鐵催化劑對碳納米管生長過程的影響，實現(xiàn)不同間隙的碳納米管的組裝（間隙尺寸從22 ± 5 到 720 ± 64 nm可控）。

圖 2 壓印的方法制作VIRRION及不同內(nèi)部間隙的碳納米管陣列

[結(jié)果驗證]  

1、捕獲驗證作者首先使用不同尺寸的熒光納米粒子驗證平臺對納米粒子的捕獲效率。在設(shè)置的三個捕獲區(qū)域內(nèi)，作者分別對400，140，25 nm的微粒進行捕獲。在500 uL/min的流速下，可以達到34.3 ± 4.5 %的捕獲效率。而在模擬手推注射器4 mL/min的流速下，該平臺依舊有22 %的捕獲效率。由于樣品排出后可以回收，將回收樣品再次注入平臺內(nèi)，可以使得回收效率進一步提高。在經(jīng)過四次重新注入的情況下，納米粒子的捕獲效率可以達到40%。這些表明了該平臺在不同流速下，對不同尺寸的納米粒子可以很好的進行分離和捕獲。

圖3 不同納米熒光粒子在芯片內(nèi)被捕獲。納米粒子按照其尺寸，在相對應(yīng)的區(qū)域所捕獲，從而達到分離不同尺寸納米粒子的作用

2、鑒定平臺及活性分析

作者為了驗證該平臺對病毒的鑒定能力，使用3種病毒建立了拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，每種病毒采樣100個點作為指紋庫。每種病毒在10²/mL的濃度下可以實現(xiàn)很好的區(qū)分。10²/mL的檢測靈敏度，接近RT-PCR。作者結(jié)合主成分分析方法（principal-component analysis, PCA)及交叉學(xué)習(xí)的機器算法實現(xiàn)了病毒的聚類分析，準(zhǔn)確度達到72%。作者通過對兩種禽流感病毒在富集前后的測序分析，結(jié)果顯示VIRRION平臺可以完整的保留病毒的基因組學(xué)信息。并且，通過富集，大大提高到了數(shù)據(jù)中病毒的含量，降低了宿主信息，進一步提高病毒鑒定的分辨率。

圖4  三種病毒建立拉曼數(shù)據(jù)庫及病毒聚類分析

3、臨床樣本分析

作者使用臨床中的鼻拭子進行三種不同病毒的捕獲與識別，通過對芯片不同位置進行電鏡觀察，可以看到三種病毒都可以很好的在相應(yīng)區(qū)域被捕獲到。使用拉曼光譜對不同病毒進行鑒定，可以清楚地區(qū)分三種病毒。使用機器學(xué)習(xí)的算法，實現(xiàn)了93 %的病毒識別。通過測序分析，三種病毒在測序數(shù)據(jù)中富集近10倍，并且病毒的基因覆蓋率得到大幅的提升。相比于傳統(tǒng)方法，該平臺可以在3分鐘內(nèi)實現(xiàn)臨床樣本的病毒捕獲和識別。

圖5 臨床樣品中三種病毒的鑒定

[總結(jié)]

文章研究思路清晰，數(shù)據(jù)翔實，實際樣品驗證完善。該文章沿用該組所擅長的碳納米管陣列，結(jié)合微流控技術(shù)，將其應(yīng)用在病毒檢測這一熱門領(lǐng)域，加之一些機器學(xué)習(xí)的內(nèi)容，使得文章比較豐滿。內(nèi)容具有一定開拓性和創(chuàng)新性。該文章沒有涉及如何解決病毒的釋放問題，只能通過整體回收的方法對富集的病毒基因組回收。這使得其分析結(jié)果只是一個整體性的分析。如果解決了這個問題，我們認為還可以進一步充分發(fā)揮可控的孔間隙所帶來的分區(qū)優(yōu)勢。病毒的富集和鑒定是傳染病研究領(lǐng)域的重要突破口，微流控技術(shù)的高通量、自動化等優(yōu)勢，將給病毒分析領(lǐng)域帶來全新的應(yīng)用分析，我們期待更多的新技術(shù)被開發(fā)用于傳染病領(lǐng)域的檢測。

撰稿人：Lxer and Jienan Shen （李星銳，沈杰男）

編輯：面面

原文鏈接：

https://www.pnas.org/content/117/2/895.short 

部分參考文獻：

1.     Y.-T. Yeh et al., Tunable and label-free virus enrichment for ultrasensitive virus detection using carbon nanotube arrays. Sci. Adv. 2, e1601026 (2016)

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