4.基于質(zhì)譜的全球單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)

已經(jīng)投入了大量努力來提高非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程的靈敏度，以達(dá)到具有良好覆蓋率、魯棒性和可靠性的單細(xì)胞分辨率。與基于親和力的方法相比，非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析允許對細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行全局映射，因此是面向發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)研究和臨床研究的理想選擇。各種樣品制備方法、自動化儀器和LC-MS開發(fā)的最新進(jìn)展使我們能夠使用無標(biāo)記方法對單個(gè)細(xì)胞中的1000多種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。在下文中，我們將討論這些令人興奮的發(fā)展，其中包括簡要討論用于單細(xì)胞分析的LC-MS系統(tǒng)的演變、微流體支持的上游樣品處理以及隨后的數(shù)據(jù)采集和分析工作流程（圖4）。

4.1微組學(xué)和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的MS進(jìn)化

基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)無疑是大規(guī)模分析蛋白質(zhì)組的組成、結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化的最全面的方法，它可以提供蛋白質(zhì)與生物學(xué)或疾病的功能聯(lián)系和分子機(jī)制。它已被廣泛應(yīng)用于各種樣品（如細(xì)胞系、動物模型和人類臨床標(biāo)本）的蛋白質(zhì)表征、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)動力學(xué)。它在蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方面的實(shí)施激發(fā)了提高蛋白質(zhì)組學(xué)分析靈敏度的巨大進(jìn)步，以克服臨床標(biāo)本的分析挑戰(zhàn)，這些標(biāo)本通常以微量存在，如初級免疫細(xì)胞和稀有細(xì)胞的子集。雖然基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)鑒定出從微尺度（微克，>1000個(gè)細(xì)胞）到大樣本的>103-104種蛋白質(zhì)，但以MS為中心的SCP主要受到缺乏小型化樣品處理方法、高效分離策略和靈敏的MS儀器的阻礙。隨著小型化樣品制備的最新進(jìn)展以及LC分離和MS儀器的改進(jìn)，對單個(gè)細(xì)胞的靈敏測量的追求一直在迅速擴(kuò)大。以下部分將討論這些進(jìn)展，并詳細(xì)介紹基于微流體的SCP分析。

小型化樣品制備在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程中，通常需要大量的樣品（>105個(gè)細(xì)胞；20μg至1 mg蛋白質(zhì)），到小規(guī)模的微基因組學(xué)（<1000個(gè)細(xì)胞；<1μg蛋白質(zhì)），大部分努力都集中在改進(jìn)微管和定制尖端的樣品預(yù)處理上，以提高分析靈敏度。例如，Kulak等人報(bào)道了in-StageTip（iST）方法，其中樣品操作是在含有由反相珠制成的非常小的圓盤的尖端中進(jìn)行的。Manza等人介紹了過濾輔助樣品制備（FASP），其中十二烷基硫酸鈉（SDS）和其他干擾LC-MS/MS分析的污染物通過分子量截止過濾裝置去除。同樣，Hughes等人開發(fā)了使用表面官能化順磁珠進(jìn)行肽脫鹽的一鍋固相增強(qiáng)樣品制備方法（SP3）。這些技術(shù)最大限度地減少了樣品轉(zhuǎn)移過程，使增強(qiáng)分析能夠減少到幾百個(gè)細(xì)胞，蛋白質(zhì)組學(xué)覆蓋范圍在3500-4500之間。與此同時(shí)，Chen等人報(bào)道了用于探測100個(gè)細(xì)胞的集成蛋白質(zhì)組分析裝置（iPAD）（iPAD-100），由此將活細(xì)胞注射到裝置中以進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)處理和分析。該裝置由浸入細(xì)胞懸浮液的入口針、控制樣品處理過程的10端口閥、用于輸送樣品的微型注射器、用于蛋白質(zhì)消化的毛細(xì)管回路（長40cm，內(nèi)徑100μm（i.d.））和用于脫鹽的C8柱組成。iPAD-100從100個(gè)細(xì)胞中鑒定出635種蛋白質(zhì)。后來，該設(shè)備升級為SCP分析的集成系統(tǒng)（iPAD-1）。使用4.5倍小的毛細(xì)管（內(nèi)徑22μm）作為單細(xì)胞輸入的關(guān)鍵部件，細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)消化在2nL內(nèi)完成，結(jié)果顯示樣品損失顯著減少。總體而言，iPAD-1從單個(gè)HeLa細(xì)胞中平均鑒定出180種蛋白質(zhì)。

LC儀器的進(jìn)步增強(qiáng)色譜分離和分辨率的顯著進(jìn)步極大地促進(jìn)了超靈敏蛋白質(zhì)組分析。已知LC內(nèi)徑的小型化和較低的流速也可以增強(qiáng)分離，從而大大增加向質(zhì)譜儀的離子輸送，并提高檢測靈敏度。已經(jīng)報(bào)道了各種窄孔柱，包括在50 nL min?1的流速下內(nèi)徑從75μm減小到30μm，將信號強(qiáng)度提高3倍，超窄孔填充柱在20 nL min-1的流量下內(nèi)徑為20μm，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞約800個(gè)蛋白質(zhì)的覆蓋率，與30 nLC系統(tǒng)相比，使用picoLC系統(tǒng)（2μm內(nèi)徑和800 pl min?2）的靈敏度提高了163倍和10至100倍。μm-i.d.柱。174幾個(gè)小組報(bào)告了用于低輸入蛋白質(zhì)組學(xué)的微流控柱陣列柱（μPAC），其由柱間距為2.5μm的較窄柱組成，柱間填充有高度有序的固定C18珠，以250 nL min?1的流速運(yùn)行，證明了對單個(gè)細(xì)胞中>1000種蛋白質(zhì)的一致定量。

5.SCP在生物學(xué)和臨床研究中的應(yīng)用

5.1靶向單細(xì)胞蛋白測定的應(yīng)用

我們介紹了各種基于微流體的靶向SCP檢測的生物學(xué)和臨床應(yīng)用（圖5）。由于微流體的獨(dú)特能力，它們對靶向SCP的實(shí)施促進(jìn)了各種細(xì)胞生物學(xué)研究和臨床研究。例如，CyTOF是靶向SCP分析最廣泛使用的方法之一，200提供了探索不同腦細(xì)胞中細(xì)胞表型的應(yīng)用（基于信號標(biāo)記物和細(xì)胞因子），免疫細(xì)胞分化，基于表面標(biāo)記物的細(xì)胞異質(zhì)性，和癌癥相關(guān)信號。 CyTOF與細(xì)胞成像相結(jié)合，也被應(yīng)用于探索組織內(nèi)或細(xì)胞過程中單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞分布，促進(jìn)了我們對免疫細(xì)胞功能的理解，以用于免疫治療應(yīng)用。最近，Neuperger及其同事使用單細(xì)胞CyTOF進(jìn)行了研究。基于13種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NSCLC）系中的異質(zhì)性和肺腺癌中的瘤內(nèi)異質(zhì)性。同樣，SCBC方法用于測量各種分泌、細(xì)胞質(zhì)或膜蛋白的多重蛋白質(zhì)豐度（由細(xì)胞產(chǎn)生的拷貝數(shù)決定）。通過仔細(xì)選擇和監(jiān)測特定蛋白質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)，SCBCs可以成為研究多種生物系統(tǒng)的工具。例如，異質(zhì)性（細(xì)胞-細(xì)胞變異）可以通過監(jiān)測參與不同信號通路的關(guān)鍵表型標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子和信號效應(yīng)器的差異表達(dá)來解決。SCBC方法也被用于通過測量在近距離孵育的細(xì)胞釋放的分泌蛋白來探索細(xì)胞相互作用和通信。這種方法用于了解細(xì)胞在不同分離條件下如何相互作用，以及信號蛋白如何影響相鄰細(xì)胞。選擇性蛋白質(zhì)標(biāo)記的SCBC分析確實(shí)已成為研究功能異質(zhì)性、117條信號通路、208條細(xì)胞間相互作用、207個(gè)細(xì)胞通訊、119個(gè)免疫細(xì)胞反應(yīng)、和CTC分析的有前景的工具。Su等人應(yīng)用SCBC芯片監(jiān)測了18種蛋白質(zhì)，包括表型標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子、單個(gè)黑色素瘤細(xì)胞中的信號效應(yīng)器，以探索藥物誘導(dǎo)的信號動力學(xué)。這項(xiàng)研究揭示了黑色素瘤在BRAF抑制劑治療下的表型轉(zhuǎn)變，BRAF抑制劑激活了包括MEK/ERK和NF-κB在內(nèi)的替代通路，進(jìn)一步加速了腫瘤進(jìn)展和耐藥性。表型。此外，Ullal及其同事使用SCBC探索了肺腺癌患者的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，并仔細(xì)選擇了90個(gè)靶標(biāo)志物來覆蓋臨床中使用的標(biāo)志性途徑（如DNA損傷、細(xì)胞死亡）和診斷標(biāo)志物。

SCP研究正以前所未有的速度蓬勃發(fā)展，對超靈敏分析的持續(xù)努力受益于多種因素，例如迄今為止討論的令人興奮的技術(shù)和分析發(fā)展。從用戶的角度來看，選擇最合適的SCP方法可能是針對特定主題的；不太可能有一種適用于所有目的的單一SCP策略。基于親和力的SCP方法非常適合探測一組特定的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的功能是已知生物現(xiàn)象或驅(qū)動疾病進(jìn)展的關(guān)鍵決定因素。與此同時(shí)，基于MS的工作流程提供了無與倫比的功能，允許以發(fā)現(xiàn)為導(dǎo)向的研究來研究與關(guān)鍵生物過程相關(guān)的蛋白質(zhì)的組成、豐度和功能狀態(tài)，并將成為全球蛋白質(zhì)組分析的有利選擇。

到目前為止，靶向SCP方法已經(jīng)報(bào)道了使用CycMIST方法檢測同一批單細(xì)胞中多達(dá)182種蛋白質(zhì)的分析。毫無疑問，對于基于親和力的SCP，一個(gè)主要的瓶頸是可靠抗體的可用性和特異性，以及相應(yīng)熒光探針和檢測通道的容量和兼容性。為了向前發(fā)展，開發(fā)更多的正交親和探針，允許靈活標(biāo)記和多重化學(xué)功能化，將能夠以更高的通量研究靶向SCP。靶向SCP的另一種策略是用適配體代替抗體，適配體產(chǎn)生更高的多重性（>1300個(gè)蛋白質(zhì)），而其他指標(biāo)（如動態(tài)范圍和特異性）也會受到影響。

考慮到LCN蛋白通常在MS衍生的測量中被掩蓋，靶向SCP與新型傳感器相結(jié)合可能會提供超敏感性的利基。與基于微流體的儀器集成的激光誘導(dǎo)熒光（LIF）和SERS在檢測LCN蛋白方面處于領(lǐng)先地位。為了提高多路復(fù)用性和吞吐量，其他傳感方式也值得考慮。例如，磁阻生物傳感是一個(gè)很強(qiáng)的候選者，因?yàn)樗某`敏度來自大多數(shù)生物樣品表現(xiàn)出可忽略的磁背景。這種基質(zhì)不敏感性大大降低了樣品預(yù)處理的復(fù)雜性。此外，對磁彈性測定法的研究表明，時(shí)間特征可以通過改變磁性納米顆粒的材料和尺寸來增加多路復(fù)用性。因此，微流體與磁阻納米傳感器的集成有望有利于LCN方案的目標(biāo)SCP分析。

MS是全球蛋白質(zhì)組學(xué)分析的核心工具。然而，全球SCP面臨著與肽離子向質(zhì)譜儀的低效輸送以及單次運(yùn)行中分析更多單細(xì)胞的有限通量相關(guān)的挑戰(zhàn)。為了促進(jìn)使用MS的全球SCP，已經(jīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和計(jì)算工作，以提高分析吞吐量和靈敏度。如本綜述所示，SCP技術(shù)的最新實(shí)驗(yàn)改進(jìn)一直強(qiáng)調(diào)通過最小化樣品體積和縮放多個(gè)樣品的分析來減少樣品損失。雖然這些方法提供了整體工作流程的小型化，但它們目前缺乏處理數(shù)百個(gè)單細(xì)胞的吞吐量。為了提高吞吐量，通過TMT標(biāo)記進(jìn)行多路復(fù)用需要額外的樣品處理步驟，以顯著提高M(jìn)S吞吐量。迫切需要一個(gè)微流體平臺，用于無縫集成小型化單細(xì)胞樣品制備和標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)更高通量的SCP分析。提高靈敏度的另一個(gè)方面是（1）將肽樣品轉(zhuǎn)移到LC和（2）單細(xì)胞水平樣品的色譜分離的改進(jìn)，這進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了向MS儀器的有效離子輸送。在這個(gè)利基市場中，微流體裝置可以直接與LC-MS/MS結(jié)合，以進(jìn)一步增強(qiáng)單細(xì)胞鑒定深度。從長遠(yuǎn)來看，基于微流體的分離、分餾和電離與質(zhì)譜的直接耦合可以進(jìn)一步避免耗時(shí)的LC分離的需要。另一方面，微流體裝置可以功能化或填充適當(dāng)?shù)母患?材料，以從低樣本量（甚至單細(xì)胞）中富集翻譯后修飾的蛋白質(zhì)（如磷酸化或糖基化的蛋白質(zhì)），或純化（通過分選和分離）稀有細(xì)胞，如CTC，用于后續(xù)的SCP分析，以鑒定新的藥物靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。此外，自動柱組成（C18顆粒或μPAC）、柱長、梯度時(shí)間、流速和其他與LC正交的方法是高靈敏度“無損”SCP需要考慮的關(guān)鍵領(lǐng)域。結(jié)合上述能力，指定的數(shù)據(jù)采集策略和適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析管道（如樣本大小的庫）前瞻性地最大限度地提高了大規(guī)模臨床SCP的蛋白質(zhì)組學(xué)深度、再現(xiàn)性、靈敏度和吞吐量。

除了基于微流體的工作流程的改進(jìn)外，分析下游SCP數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算管道也很有趣。目前的光譜數(shù)據(jù)處理方法表現(xiàn)出有限的識別率、相對耗時(shí)的庫構(gòu)建和吞吐量，這影響了從SCP數(shù)據(jù)中提取生物關(guān)鍵信息。為此，基于深度學(xué)習(xí)的模型可以與計(jì)算管道一起使用，以提高識別能力，并生成預(yù)測庫，以盡可能少的資源補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)庫。

在目前的蛋白質(zhì)組學(xué)深度，SCP技術(shù)已經(jīng)在單細(xì)胞分辨率上展示了幾種應(yīng)用。這些應(yīng)用已經(jīng)從細(xì)胞系擴(kuò)展到單個(gè)細(xì)胞水平的空間分辨腫瘤組織。這些研究大多集中在樣品制備的改進(jìn)或數(shù)據(jù)采集策略的優(yōu)化上，最新技術(shù)使每個(gè)細(xì)胞能夠鑒定1000-1500種蛋白質(zhì)。為了應(yīng)對微基因組學(xué)，最近，plexDIA將非等壓質(zhì)量標(biāo)簽與DIA相結(jié)合，分析納克級樣品，從而提高吞吐量，并以98%的數(shù)據(jù)完整性量化每個(gè)細(xì)胞約1000種蛋白質(zhì)。展望未來，SCP MS有望實(shí)現(xiàn)測量數(shù)千多種蛋白質(zhì)和量化單個(gè)細(xì)胞中功能相關(guān)蛋白質(zhì)的目標(biāo)，這將進(jìn)一步促進(jìn)SCP在更廣泛的生物系統(tǒng)中的應(yīng)用，并指導(dǎo)醫(yī)學(xué)的未來。這一進(jìn)展反過來將加速診斷疾病和探索癌癥治療藥物靶點(diǎn)的臨床檢測的發(fā)展。最近的SCP發(fā)展也有可能改變發(fā)育生物學(xué)。隨著從典型哺乳動物細(xì)胞中鑒定出1000多種蛋白質(zhì)，基于微流體的方法有望從卵母細(xì)胞或早期胚胎等大型細(xì)胞中檢測出數(shù)千種蛋白質(zhì)。通過上述改進(jìn)，SCP將為干細(xì)胞分化、早期胚胎發(fā)育和器官發(fā)育提供有價(jià)值的見解。

隨著微流體細(xì)胞檢測技術(shù)的進(jìn)步，單細(xì)胞的微操作驗(yàn)證了核酸和蛋白質(zhì)的可控取樣，為動態(tài)細(xì)胞生物學(xué)的研究鋪平了道路，其中細(xì)胞間通訊、微環(huán)境調(diào)節(jié)和時(shí)空細(xì)胞動力學(xué)被揭示。由于僅依賴單體信息有限地回答和連接了基因型和表型之間潛在的生物不確定性；CITE-seq和nanoSPLITS 等幾項(xiàng)工作將蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程與成熟的單細(xì)胞RNA測序技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了雙模分析。最近，各種微流體平臺（無論是液滴還是微孔）已經(jīng)提出了多模態(tài)分析，由此產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)框架需要在生物信息學(xué)上實(shí)施深度學(xué)習(xí)，這在計(jì)算上推動了多組學(xué)時(shí)代的到來。展望未來，預(yù)計(jì)多層微流體可以設(shè)計(jì)為容納多個(gè)功能模塊，用于進(jìn)行多組學(xué)或動態(tài)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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