流式細胞術是一種廣泛而強大的技術，其分辨率取決于其準確區分熒光陽性人群和陰性人群的能力。然而，在進行常規流式細胞術的測量時，大多數信息豐富的結果都被丟棄了，例如未純化生物樣本中標記的外泌體的細胞大小、形狀、形態和分布或位置。在此，我們提出了一種使用具有各向異性特征的抗衍射光片來激發熒光標簽的新方法。由抗衍射貝塞爾-高斯光束陣列組成，光片為12μm長，12μm高，厚度約為0.8μm。因此，激發熒光信號的強度分布可以反映尺寸，并允許樣品在0至10μm通過微流控芯片中的流體動力學聚焦進行運輸。采樣率為500 kHz，在不犧牲空間分辨率的情況下提供高吞吐量的能力。因此，所提出的抗衍射光片流式細胞術（ADLSFC）可以獲得比傳統方法更具信息量的結果，并且能夠提供多種特征，有助于將目標樣品與復雜背景區分開。

流式細胞術（FC）是一種強大的分析技術，能夠快速分析流過單個或多個激光截距點的溶液中的細胞和顆粒。由于其計數、表征和分類細胞的能力，它已被廣泛應用于細胞分析和疾病診斷。

在過去的三十年里，世界各地的幾個研究小組參與了微流控流式細胞術的研究。已經開發了各種類型的流式細胞儀，包括聲聚焦細胞儀、細胞分選儀、成像細胞儀、質量細胞儀和用于珠陣列分析的細胞儀。聲聚焦細胞術使用超聲波來幫助聚焦細胞進行激光詢問。優點是它不需要高速或大體積的鞘流。然而，它的吞吐量低，設備復雜龐大。細胞分選機通過液體樣品流的高頻振蕩產生液滴來分離細胞。然后，液滴被賦予正電荷或負電荷，并穿過金屬偏轉板。最終，它們會根據電荷被引導到特定的收集容器。細胞分選機具有高分離純度和靈活性，但它沒有樣本詳細信息。

結合熒光顯微鏡，成像流式細胞術（IFC）允許在單細胞水平上快速分析生物樣本的形態和多參數熒光，而IFC的高空間分辨率只能通過犧牲吞吐量來實現，即每秒分析的生物樣本數量。例如，使用電荷耦合器件（CCD）對一個細胞成像所需的時間跨度可以短至1ms，這意味著最大吞吐量僅為每秒1000個細胞。此外，IFC需要較大的存儲空間，分析時間較長。

質譜儀結合了飛行時間質譜和流式細胞術。細胞用重金屬離子標記的抗體（通常來自鑭系元素家族）而不是熒光抗體標記，并使用飛行時間質譜法檢測。由于不使用熒光標記，因此不需要光補償。然而，樣本細胞被破壞，無法在下游進行分析。使用細胞儀進行珠陣列分析是一種檢測特異性結合到樣品上的熒光珠的技術。通過評估熒光強度，可以量化與珠子相關的樣品數量。

傳統的流式細胞術通常“體積龐大”，分離純度相對較低[1]。隨著微流體和微型技術的快速發展，在過去的十年里，便攜式、高度集成和易于操作的流動系統得到了發展。例如，Jiang等人通過耦合電動誘導的壓力驅動流進行熒光顆粒計數，設計了一種小型化的雙波長熒光檢測芯片。Kanwa等人使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造了一種形狀像葫蘆的微流體裝置，用于捕獲和定量分析染色的外泌體。Lee等人提出了一種聲學納米過濾系統，該系統以連續和非接觸的方式分離特定尺寸的微囊泡。這些新的細胞檢測設備豐富了流式細胞儀設備家族。

然而，FC的性能是關鍵參數之一對其他參數的折衷，從而限制了它的應用。生物樣本的形態特征通常是幫助區分一個群體與另一個群體的關鍵參數之一。例如，大腸桿菌是一種典型的革蘭氏陰性桿菌，其長度在1到幾十微米之間，反映出獨特的活性。在采用橢圓形和球形焦斑的傳統FC中，無法檢測到細胞在通過截距點時的大小、形狀和方向的差異，這使得區分活性細胞變得困難。相比之下，當非球形物體經過時，具有大縱橫比的焦斑（例如，光片）會產生獨特的強度分布（圖1）。Miura等人將光片實現為定制的IFC，旨在將每個圖像像素的熒光強度提高約10倍。據我們所知，這些研究人員都沒有利用高縱橫比的焦斑來提高FC的空間分辨率。

在這項研究中，我們設計了一種新型的流式細胞術系統，使用高度各向異性和抗衍射的光片（ADLS）作為激光攔截點。ADLS是由空間光調制器（SLM）通過條紋分裂相位（SSP）方法產生的平行且緊密排列的貝塞爾-高斯光束形成的。貝塞爾-高斯光束是一種具有矢量偏振的光束。它具有幾個驚人的特性，例如抗衍射、自愈、大焦深和低干涉，即使其中兩個是平行且緊密放置的。因此，可以使用具有大面積和良好均勻性的貝塞爾-高斯光束陣列來生成ADLS。此外，自我修復功能使ADLS在通過復雜解決方案時不會失真。在目前的研究中，ADLS的尺寸為12μm長，12μm寬，0.8μm厚度。該規范使我們能夠以亞微米的空間分辨率測量大型和小型物體。穿過不同大小、分布甚至姿態的物體會產生不同的強度分布，可以對其進行計數和分析。對于傳統FC來說，這是無法實現的。結合光電倍增管和高速數據采集模塊，500 kHz可以容易地實現采樣率。最大計數率可以是每秒至少104個事件。因此，所提出的方法大大提高了傳統FC的空間分辨率，適用于對具有復雜物理和化學特征的生物樣本進行分選和分析。

系統設置

實驗系統如圖2a所示。在這個實驗中，473nm，連續波激光器作為光源。激光束首先被空間濾光片過濾，然后被擴束器準直。通過分束器進一步調整光束，和偏振器。穿過偏振器后，線偏振光束的方向與SLM的液晶的方向平行。調制光束進一步被引導到倒置熒光顯微鏡系統中，并用物鏡聚焦，以在焦點處產生ADLS。顯微鏡有一組濾光片，包括二向色鏡和帶通濾波器，從激發光中提取熒光。

使用流式細胞術制造的微流控芯片中的ADLS實現顆粒檢測、測量和分析（圖2a插圖）。微芯片有三個入口。A和C入口用于水流，而B入口用于樣品溶液。這三種溶液在接頭O處接觸，并在下游形成鞘流。微通道AO、BO和CO為100μm寬度為10μm在高度上。試驗箱，即DO部分，為50μm寬度為10μm在高度上。

微流控芯片的空間位置由納米壓電臺改變，使ADLS位于微通道的中心。當熒光顆粒以給定速度通過ADLS時，ADLS激發熒光顆粒發出熒光。熒光信號依次通過帶通濾波器和二向色鏡，然后被探測器捕獲。使用顯微鏡中的分束器，20%的熒光被SCMOS相機捕獲，以監測ADLS。剩余的80%熒光被聚焦到光纖中，并用光電倍增管（PMT）。ADLS被放置在測試室中，以檢測射流中的樣品，如圖2c、d所示。相比之下，零階光點被聚焦到鞘流中。只有通過ADLS的樣品的熒光才能聚焦到光纖中。零級光激發的可能熒光已被阻斷。

PMT與放大器結合，將熒光信號轉換為電信號。然后，在嵌入式板上的16位模數轉換器收集并轉換為數字原始數據后，數據最終被發送到計算機進行處理和分析。系統的采樣率高達500 kHz.

微流控芯片的制備

根據圖3所示的程序，通過使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的軟光刻技術制造微通道。首先在硅晶片上使用負性光致抗蝕劑SU-8 3025制造溝道層。10分鐘后在預烘烤過程中，使用接觸掩模對準器將涂有光致抗蝕劑的晶片暴露于紫外光下。后烘烤后通過開發，得到了模板。隨后使用PDMS復制模板的結構。PDMS微通道進一步粘合到載玻片上，并沖壓有入口和出口，以形成所需的微流體芯片。

免責聲明:文章來源doi.org/10.3390/mi14030679 以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除。