微流體用于核酸富集、分離和無PCR檢測中雙孔二氧化硅納米結(jié)構(gòu)

高效的病原體富集和核酸分離對于準確、靈敏地診斷傳染病，尤其是病原體水平低的傳染病至關(guān)重要。我們的研究引入了一種雙孔二氧化硅納米膜嵌入的樣品制備芯片，用于病原體和核酸富集/分離。該芯片具有獨特的雙孔納米結(jié)構(gòu)，包括大孔層和小孔層。計算模擬證實，這些納米結(jié)構(gòu)增強了表面積并促進了納米渦旋的形成，從而提高了捕獲效率。值得注意的是，與用于核酸檢測的傳統(tǒng)方法相比，該芯片的檢測限降低了 100 倍。使用患者樣本的臨床驗證證實了該芯片與發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移測定相結(jié)合時具有卓越的靈敏度。該芯片的樣品制備效率不斷提高，雙孔納米結(jié)構(gòu)的合成簡單明了，為核酸的無聚合物鏈式反應(yīng)檢測提供了有前途的解決方案。

核酸 （NA） 可作為診斷生物標志物，準確、靈敏地診斷各種疾病，包括癌癥、遺傳性疾病和傳染病。特別是在傳染病中，分子診斷，如基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的檢測，是早期診斷的理想選擇，因為與癥狀出現(xiàn)后較慢的抗體反應(yīng)相比，病毒基因組的快速和大量積累。然而，在無癥狀或癥狀前期間，病原體的低濃度給檢測帶來了挑戰(zhàn)，無需進行樣本制備，例如病原體和核酸富集/分離。

商業(yè)NA提取方法主要依賴于表面結(jié)合，其中NA粘附在色譜柱、磁珠或微流體通道的固體表面上。然而，離心柱或基于微球的平臺很費力，而且樣品量有限。相反，微流控系統(tǒng)處理更大的樣品體積，并有效地將目標分子（如細胞、細菌、病毒和 NA）輸送到表面。然而，在考慮關(guān)鍵的液固界面時，由于結(jié)合位點受限和防滑邊界條件，具有光滑和平坦表面的微流控芯片在提高結(jié)合效率方面表現(xiàn)出局限性。

解決這個問題的一種代表性方法是實施微混合器，以促進對流向地表的傳質(zhì)。雖然微混合有助于將目標輸送到更靠近表面的位置并縮短必要的擴散長度，但它仍然受到防滑邊界條件的限制。更直接的方法是增加表面積，并通過三維（3D）多孔結(jié)構(gòu)滑動流動。納米制造技術(shù)，如圖案化、光刻和激光打印，已被用于創(chuàng)建這些多孔結(jié)構(gòu)，但這些技術(shù)密集型、高度復(fù)雜且耗時，限制了它們滿足對微流控系統(tǒng)作為樣品制備芯片日益增長的需求的能力。例如，Zhang等人開發(fā)了一種用于外泌體檢測的3D納米圖案微流控芯片。該芯片的納米多孔域增加了表面積，促進了排水流動，并降低了表面附近的流體動力阻力，提高了捕獲效率。然而，由于芯片尺寸小（從微米到厘米不等），納米多孔域占總通道高度的 30-70%，因此芯片的吞吐量有限。因此，需要額外的樣品制備過程，如超速離心來分離和濃縮樣品。

我們介紹了一種簡單、經(jīng)濟高效的大規(guī)模樣品制備芯片制造方法，該芯片使用兩片聚對苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 薄膜和刻有微通道的雙面膠帶組裝而成。該芯片包含薄而均勻的納米結(jié)構(gòu)，具有小孔和大孔，稱為雙孔二氧化硅納米膜 （BSNF）。在計算模擬和顆粒接近測試中，這些獨特的納米結(jié)構(gòu)顯著增強了表面積和表面滑移流，同時在每個納米孔中誘導(dǎo)了納米渦旋，改善了病原體和NA的富集/分離。通過將 BSNFs 嵌入式樣品制備芯片 （BSNFs-chip） 整合到基于 PCR 的檢測中，與使用傳統(tǒng)方法獲得的 LOD 相比，我們的檢測限（LOD）降低了100倍。此外，將來自 BSNFs 芯片的富集樣品與發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移 （LRET） 測定相結(jié)合，證明了其在臨床樣本中快速靈敏地檢測嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）RNA 的潛力。

結(jié)果

BSNFs芯片的工作原理、設(shè)計和制造

圖 1 說明了制備用于病原體和 NA 富集/分離的 BSNF 芯片所涉及的工作流程。BSNFs是在大型商業(yè)PET薄膜（10 cm×7 cm）上合成的，作為樣品制備芯片的頂部和底部基板。兩層BSNF示意圖合成分為四個步驟：（i）合成具有小孔隙的初始二氧化硅層;（ii） 去除膠束模板;（iii）合成具有大孔隙的后續(xù)二氧化硅層;（iv）去除膠束模板。膠束組分之間的pH依賴性相互作用影響膠束聚集，導(dǎo)致多孔二氧化硅納米膜（PSNF）中形成小孔隙，在BSNF中形成大孔隙（補充圖1）。BSNFs芯片是通過將兩片BSNF合成的PET薄膜與微通道雕刻的雙面膠帶連接起來組裝而成的。BSNF在微流控通道內(nèi)的表面被3-氨丙基（二乙氧基）甲基硅烷（APDMS）官能化，以促進病原體和NA的結(jié)合。隨后，BSNF芯片加載臨床樣品和己二酸二酰肼（ADH）作為交聯(lián)劑。BSNF （BSNF-NH2） 的胺官能化表面通過靜電偶聯(lián)和與 ADH 交聯(lián)的共價結(jié)合捕獲病原體和 NA。最后，通過將洗脫緩沖液引入微通道來獲得濃縮樣品。

圖1：BSNFs芯片設(shè)計和樣品制備過程示意圖

我們利用掃描電子顯微鏡（SEM）表征了扁平硅片和PET薄膜襯底上的雙孔納米結(jié)構(gòu)（圖2a）。俯視圖 SEM 圖像和 Feret 直徑分布的直方圖顯示，第一層 PSNF34 是一種高度均勻的薄膜，平均 Feret 直徑為 ~59.45 nm（圖 2b）。在第二層合成過程中，通過膠束聚集和二氧化硅生長形成了兩層BSNF。BSNF第二層的平均雪蘊直徑為~230.9 nm，大于PSNF第一層的平均直徑。BSNF 的小角 X 射線散射 （SAXS） 剖面在 ~0.45 nm?1 處顯示散射峰，表明 PSNF 的存在，而強度的降低歸因于較大孔隙距離的增加。BSNF的橫視圖SEM圖像顯示總高度為~400 nm，第一層和第二層之間有明顯的邊界（圖2c）。兩個 BSNF（頂層和底層）在微通道內(nèi)的總高度約為 800 nm。值得注意的是，BSNF代表薄涂層，僅占300μm總微通道高度的0.27%。

圖2：高比表面積BSNF的大規(guī)模均勻合成

開發(fā)了模擬真實孔隙的虛擬模型來研究納米結(jié)構(gòu)的表面積（圖2d-f）。與平坦表面相比，PSNF的模擬表面積顯著增加了1244%，而BSNF的模擬表面積增加了1863%（圖2g）。圖2h顯示了在大面積透明PET薄膜上合成的BSNF的照片，圖2i顯示了用BSNF制造的BSNF芯片的圖片。我們通過注入帶負電的量子點 （QD） 評估了帶正電表面的 BSNF 芯片的捕獲效率（補充圖 7）。PSNFs嵌入式樣品制備芯片（PSNFs-chip）的平均熒光強度與現(xiàn)有的平面樣品制備芯片（Flat-chip）相比具有更高的值，而BSNFs芯片表現(xiàn)出比PSNFs芯片更大的強度，從而表明其具有優(yōu)越的捕獲能力。這些結(jié)果證實，與裸露的PET薄膜的平坦表面相比，PSNF和BSNF的表面積增加是由于納米結(jié)構(gòu)造成的。

我們對三個虛擬模型進行了數(shù)值模擬，以仔細檢查流體流動并評估 BSNF 芯片的增強傳質(zhì)。這種增強是通過（i）消除納米結(jié)構(gòu)上的防滑條件來實現(xiàn)的;（ii）在納米結(jié)構(gòu)內(nèi)產(chǎn)生渦流（圖3）。正如直觀地預(yù)期的那樣，多孔結(jié)構(gòu)的引入促進了納米結(jié)構(gòu)上和內(nèi)部的流體流動。然而，裸PET的防滑底部沒有流動。由于PSNF和BSNF模型中的切向滑移流，每個孔隙中都形成了納米級渦流。這些渦流驅(qū)動流體流向納米結(jié)構(gòu)，從而增強了來自塊狀流體的質(zhì)量傳遞和顆粒-表面碰撞的頻率（即結(jié)合效率）。

圖3：BNSF的動態(tài)流量剖面

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