1 染料定性表征濃度梯度

隨著熒光素鈉與莧菜紅流速比的增加, 熒光素鈉成分在通道中所占比例逐漸增加。當流速比 < 1時, 莧菜紅在4個通道中含量較高(圖 2A~D); 當流速比 > 1時, 熒光素鈉在4個通道中含量較高, 不利于拉開濃度差異, 形成濃度梯度(圖 2I~L、M~P); 當兩水相流速比為1時(即流速均為100 μL·h-1), 芯片可以生成較好的濃度梯度, 接近于線性濃度梯度(圖 2E~H)。同時, 結果可以看出當流速差異較大時, 兩水相分界清晰, 流體在流動過程中不能充分擴散(圖 2I~L、M~P)。所以選擇兩水相流速均為100 μL·h-1作為后續藥物篩選實驗時的水相流速。

2 HPLC定量表征濃度梯度

氟康唑在1~100 μg·mL-1內線性良好, 回歸方程為f = 1 769.3×C - 1 507.3 (r = 0.999 7)。空白溶液與100 μg·mL-1氟康唑溶液流速比1:2、1:1、2:1, 分別收集4個通道樣本進行檢測, 結果見表 1。當流速為1:2和2:1時, 溶液流速差異大, 高流速溶液流經同樣距離所需時長越短, 橫向擴散距離也較短, 分支中溶液混合情況差, 難以形成線性濃度梯度。當空白溶液與工作溶液流速比為1:1時, 各分支溶液能夠較充分混勻從而能夠獲得更加接近線性的濃度梯度, 與熒光素鈉對芯片濃度梯度定性結果一致。

3 濃度梯度微流控芯片的系統考察

為了生成大小均勻、形狀穩定的液滴, 考察了芯片上的水油兩相流速, 見圖 3。結果表明, 水相流速100 μL·h-1、油相流速200 μL·h-1時, 液滴大小均一, 形態良好, 液滴直徑約為47 μm, 體積約54 pL, 生成速度約為每秒2.6×104個。收集的液滴涂布于載玻片上觀察, 液滴形態比較穩定, 尺寸均一, 放置3天, 液滴仍能保持形態完好, 穩定性高, 完全滿足實驗要求。

4 液滴包裹白念珠菌考察

白念珠菌菌液與空白培養基作為兩水相包裹形成液滴后, 涂片于載玻片, 顯微鏡下拍照觀察。對液滴直徑進行測量和標記, 結果發現液滴直徑基本為46.64 μm, 尺寸大小基本保持一致, 液滴均一性良好。白念珠菌經活死染料標記, 可以清晰地觀察到大多數液滴為空液滴, 而包裹了白念珠菌的液滴基本為單包裹。由于白念珠菌濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1, 菌液濃度相對較低, 分散到每個液滴內的白念珠菌基本為1個或沒有, 因此液滴絕大多數為單包裹(圖 4)。在單細胞包裹液滴中, 當藥物抑制或者殺滅真菌細胞時, 無熒光亮液滴, 顯示與空液滴一樣的背景色。當藥物濃度低于MIC時, 真菌細胞有生長活性, 指示劑轉化產生熒光亮液滴, 而空液滴保持不變。由此可以判斷藥物的MIC。因此, 通道內白念珠菌的濃度梯度分布不影響后續的藥物篩選實驗。

5 基于濃度梯度微流控芯片的抗真菌藥物快速篩選研究

分別測試高低濃度的兩性霉素B的抗白念珠菌作用, 高濃度組水相分別為含16.0 μg·mL-1兩性霉素B的藥物溶液和含終濃度為0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1白念珠菌的溶液, 低濃度組兩性霉素B濃度為4.0 μg·mL-1, 其余組成相同。16.0 μg·mL-1兩性霉素B濃度梯度微流控芯片抗真菌活性實驗結果見圖 5。空白對照組中液滴只包裹了藥物溶液(無菌), 可見液滴顏色均勻一致為背景的紅色, 液滴無熒光(圖 5A); 生長對照組(無藥), 熒光亮液滴較多(圖 5D), 圖 5B~C中液滴無熒光, 表明白念珠菌的活力被兩性霉素B抑制, 無法有效轉化熒光指示劑產生熒光。

4.0 μg·mL-1兩性霉素B液滴實驗結果見圖 6, A~D分別為通道1、通道2、通道3、通道4出口處收集液滴孵育2 h后的結果。根據氟康唑濃度梯度定量表征結果推算, 圖 6A~D中兩性霉素B分別為4.0、1.6、0.5和0 μg·mL-1。A為空白對照組, 無熒光亮液滴; D為正常生長對照組, 產生大量亮液滴。圖 6B中所示為藥物溶液與菌溶液混合后的液滴作用情況, 液滴中無明顯熒光信號產生, 表明該濃度條件兩性霉素B可以有效抑制白念珠菌生長, 兩性霉素B濃度約為1.6 μg·mL-1; 圖 6C中可以看到液滴存在明顯的明暗區別, 表明液滴內包裹的白念珠菌未能被有效抑制, 而兩性霉素B濃度約為0.50 μg·mL-1, 因此可以得出兩性霉素B的MIC值在0.50~1.60 μg·mL-1內, 與CLSI所建議的兩性霉素B對白念珠菌的MIC≤1 μg·mL-1相一致。結果表明本研究建立的濃度梯度微流控芯片平臺可以用于快速測定抗真菌候選化合物的MIC, 通過一次實驗獲得化合物的MIC范圍(表 2)。

氟康唑、卡泊芬凈、特比萘芬等藥物結果與96孔板法一致。圖 7顯示了16 μg·mL-1特比萘芬抗白念珠菌藥物篩選實驗結果。其中, 7B~D中均有熒光亮液滴, 說明兩種濃度的特比萘芬均不能有效抑制該批次白念珠菌的活性, 該批次白念珠菌對特比萘芬產生了耐藥的現象。有文獻報道, 在臨床獲得的白念珠菌樣品中, 對特比萘芬的耐藥比例達94.93%, 而伊曲康唑和咪康唑的耐藥率則只有15.21%和5.99%。本研究所建立的抗白念珠菌藥物篩選的方法也可以應用于臨床耐藥菌株的藥物篩選研究。

討論

在微流控芯片上生成濃度梯度具有自動化、微型化、高通量的優點, 因此被廣泛應用于藥物篩選、細胞生物學等研究領域。本研究采用液滴微流控技術結合濃度梯度生成的芯片包裹白念珠菌進行抗真菌藥物活性快速高效測試。通過熒光示蹤劑熒光素鈉和莧菜紅色素考察芯片上兩水相流速比對濃度梯度形成結果的影響, 并對芯片濃度梯度進行了定性表征, 結合HPLC對通道內氟康唑濃度的定量從而對芯片濃度梯度進一步進行定量表征。濃度梯度定性與定量結果一致表明, 當兩水相流速比為1 : 1時, 流速為100 μL·h-1時, 芯片內濃度梯度分布更加均勻, 濃度梯度分布接近線性, 適用于后續藥物篩選實驗。通過活死染色考察芯片上濃度梯度生成器對白念珠菌在通道中分布及液滴內包裹白念珠菌情況的影響, 結果發現液滴內白念珠菌基本為單包裹, 藥物作用對象保持一致。

采用本實驗室設計制作的濃度梯度液滴微流控芯片, 測試了8種臨床常用藥物的抗白念珠菌作用效果。通過對兩性霉素B、氟康唑及特比奈芬等藥物的作用效果考察發現, 芯片結果與孔板法一致, 并與M27-A3標準所認定的MIC值相符, 表明本研究建立的多濃度梯度液滴生成芯片平臺可以用于抗真菌活性化合物的快速篩選及臨床耐藥菌株的篩選研究。傳統孔板法藥敏實驗需要耗費大量人力物力, 難以實現高通量分析。

近年來, 濃度梯度微流控芯片技術逐漸興起, 出現大量能夠產生線性和非線性濃度梯度的微流控芯片, 但其結構網絡較為復雜、制作要求較高, 芯片穩定性和重現性易受影響。本文建立的濃度梯度液滴微流控芯片平臺將濃度梯度生成器和液滴生成結構組合在一起, 濃度梯度生成器采用經典的“圣誕樹”結構, 可通過簡單地增加分支數目而獲得更多的濃度梯度分布, 結構簡單易于制作, 并且芯片穩定性高, 易于操作, 能夠快速生成較為精確、穩定的濃度梯度。將該平臺應用于抗真菌藥物篩選, 可以省去配制多種不同藥物濃度溶液的繁冗過程, 同時簡化了細胞鋪板、給藥、標記等過程。在短時間內可以生成大量液滴, 每個液滴作為獨立微反應器, 作用結果互不干擾, 增加了實驗結果的可靠性與準確性。后期通過改進芯片“圣誕樹”結構濃度梯度分支數目, 增加芯片的濃度梯度生成數量, 可以將一次實驗所獲得的濃度梯度間隔劃分的更小, 有望通過一次實驗獲得精確的MIC值; 通過改變濃度梯度生成器結構, 可以產生正交濃度梯度用于聯合用藥的研究。

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