8. 微流體：提高生理相關性的宏觀步驟

微流體依靠使用高度或寬度為10-100微米的小通道來處理少量流體。與其他更傳統的3D細胞模型相比，它們的關鍵屬性是它們能夠更好地控制細胞、物理和生化微環境。這使研究人員能夠重建復雜的細胞模型，更真實地模擬人體組織。
微流控芯片的設計可以由許多不同的通道或隔間組成，可以很容易地適應研究人員的需要。這種分區允許在生理長度尺度上對細胞分布進行獨特的空間控制，特別是對于不同細胞類型的共培養。許多微芯片現在已經在微芯片上集成了電子和機械執行器，例如閥門或開關，這有助于在同一芯片上實現幾個連續的步驟。這一概念通常被稱為芯片上實驗室：許多耗時的實驗室任務可以被微型化并自動化到微流控芯片上。與傳統的宏觀分析相比，這種小型化還減少了所需試劑和細胞的體積，從而降低了成本。
通道的存在允許在生理長度范圍內控制流量。這有助于跨通道形成化學或物理梯度(例如，細胞因子梯度或間質壓力)，這在許多生物過程中是重要的。測定中流動的建立有利于介質的灌流，重建重要的生物力學過程，如剪切力，或簡單地允許重建血流中細胞的流體環境。
最后但并非最不重要的一點是，微流控芯片中的細胞與顯微鏡物鏡之間的距離較短，能夠以比其他傳統的體外宏觀系統更高的分辨率成像整個樣品。
與微芯片相關的一些重要限制：主要的限制之一是，如果需要進行后續測試，細胞很難取回。此外，即使檢索到這些卷，其大小也可能不足以進行后續測試。然而，為了適應3D細胞培養市場的需求，即使是這些挑戰也正在與其他挑戰一起逐漸被克服。

9. 顯微鏡下3D細胞培養的未來
為了跟上藥物發現和細胞治療市場日益增長的需求，3D細胞培養面臨著許多挑戰。
第一個問題是重復性：通常情況下，3D細胞培養結果變化太大。這種可變性的來源有三個方面。第一個是生物學上的。眾所周知，細胞和細胞衍生產品(如Matrigel或血清)在不同批次的生產中存在廣泛差異?？勺冃缘牡诙€來源是基于用戶的：與3D細胞培養相關的許多程序，如移液，都是手動完成的，因此容易發生用戶依賴的可變性。最后，許多方案可能會受到環境因素的影響，而這些因素在分析中往往不是本地控制的，例如溫度或濕度，這可能會對3D凝膠聚合等關鍵步驟產生非常大的影響。與此同時，3D細胞培養程序遠非易事。它們需要專業和訓練有素的工作人員，而缺乏這些工作人員正在阻礙市場增長。此外，這些任務既耗時又昂貴。
這些問題都指向了3D細胞培養領域的兩大需求：自動化和標準化。理想情況下，需要新的產品來促進這些3D細胞培養過程并減少人為干預，從而將人為錯誤降至最低，加快方案并提高吞吐量和重復性。細胞傳代或細胞擴增等任務的自動化已經在進行中。
3D細胞培養領域的另一個主要瓶頸是缺乏方便的讀數。太多的研究嚴重依賴3D成像來分析細胞形態、遷移或生存能力。這需要大量的時間和使用昂貴的專業設備，如共焦顯微鏡。盡管考慮到這些變量的信息量很大，這仍然是必要的，但也需要努力開發更容易的讀數。與此同時，還需要努力標準化分析方法，以量化這些結果：重建3D圖像遠非易事。雖然商業上有幾個3D重建軟件包，但從這些復雜的數據集中定義、提取和量化新的變量仍然是困難的。

總而言之，我們預計這些方法學上的挑戰將需要解決，以便在臨床背景下促進3D細胞培養的流程化。這些技術進步有望幫助該領域朝著以下方向發展：血管化、類器官/iPS細胞、芯片上器官、個性化醫學和免疫活性模型。
人們對血管化的細胞模型非常感興趣。首先，這大大增加了它們與藥物發現目的的生理相關性。事實上，許多疾病和生物過程與血管系統的存在、破壞或形成密切相關。例如，癌細胞在從原發腫瘤遷移并在遠處器官中形成繼發腫瘤時與血管系統發生嚴重的相互作用。在體外對血管系統進行建模也有助于通過血液循環重建藥物輸送。其次，出于細胞治療的目的，血管化組織將有更高的機會長期植入患者體內。
正如前面所討論的，另一個日益引起人們興趣的領域是有機化合物的使用。目前的努力在于使它們的制作方案標準化，但也有必要使它們血管化，原因如前所述。
芯片上的器官在藥物發現領域引起了人們的極大興趣，在過去的幾十年里，許多學術團體開創了這一領域的先河。緩慢但肯定的是，許多不同器官的原型正在出現，這項技術現在正朝著同時集成幾個相互關聯的器官的芯片方向發展，以模仿更系統、更完整的模型。這些模型可能成為測試藥物和構成細胞植入物的生物材料的細胞毒性的替代品。
所有這些發展都是在更普遍的個性化醫學范式轉變下出現的。個性化醫學傾向于開發針對患者自己的細胞定制的治療和診斷工具。換句話說，現在人們認為，在不久的將來，可以從每個患者身上提取細胞，并將其整合到本綜述中描述的任何一種3D細胞培養試驗中，以便在體外重建患者自己的組織。
最后，我們預計免疫活性模型將成為3D細胞培養領域的關鍵發展?，F在越來越清楚的是，免疫細胞在許多疾病中發揮著關鍵作用，實際上可以直接作為幫助患者的手段。癌癥免疫療法的成功證明了這一點，這種療法可以重新教育免疫細胞，使其更好地識別和抗擊癌癥。因此，將免疫細胞包括在3D體外細胞模型中將變得至關重要，以更好地了解它們的作用并篩選可以針對它們的藥物。有趣的是，一項研究表明，許多在老鼠身上有效的藥物在人類身上產生了不可預見的副作用，因為它們具有免疫抑制作用。因為它們削弱了免疫系統，機會性病原體成為患者感染的原因。因此，臨床前模型應該包括免疫細胞來預測患者免疫抑制的風險。免疫系統也是生物材料植入后經常引發的炎癥的罪魁禍首。將免疫細胞納入體外模型將有助于更好地預測生物材料引起有害反應的可能性。
有趣的是，這項研究揭示了免疫抑制藥物往往與人類的毒副作用有關，這不僅揭示了免疫細胞，也揭示了病原體。換句話說，雖然這些藥物也會抑制老鼠的免疫系統，但老鼠身上的病原體與人類的不同。對于那些根據自己的情況或治療而可能擁有獨特微生物群的患者來說，情況尤其如此。因此，一個理想的藥物測試體外模型也可以包含人類病原體，以預測與藥物治療相關的感染。
對于所有這些3D細胞培養的發展，最大的挑戰將在于檢測驗證。事實上，人們需要驗證體外數據的相關性和有效性，并將它們與體內結果進行比較。首先，這意味著我們需要為廣泛的疾病識別相關的生物標記物，我們可以在體外模型和人類臨床數據之間進行比較。其次，需要努力尋找可以與體外模型進行比較的人類臨床數據。雖然如此多的挑戰很可能會通過無數的社會和技術改進來解決，但我們認為微流控芯片可能是解決我們提出的幾個問題的一個有前途的途徑。

10. 微流控可以做些什么？

首先，微流控技術在自動化和加速繁瑣的桌面程序方面已經顯示出巨大的潛力。例如，一些微流控芯片具有自動化的ELISA協議，并且在將質譜學結合到微流控芯片上進行了大量的工作。這將成本和時間降至最低，但也通過最大限度地減少人為干預來幫助標準化結果。然而，向3D細胞的操作邁進可能會被證明是更困難的。雖然在微流控工具中操縱流體是常規操作，但操縱和混合不同粘度的溶液(如細胞懸浮液和3D水凝膠)更具挑戰性，因為它需要一套設備來克服層流流動。
研究小組還找到了將微流控芯片與簡單讀數相結合的方法。例如，懷特賽德小組已經開發了基于紙張的比色微流控技術，這樣只需通過顏色變化就能顯示出檢測結果。微流控芯片在促進個性化藥物方面也具有明顯的優勢，因為它們需要少量的細胞，因此這些細胞可能都來自患者。
與此同時，已經在努力開發具有受控環境的微流控芯片，就像生物反應器一樣。例如，重新創造低氧環境的微流控工具已經被創造出來，以模擬癌癥組織中的低氧。在另一項研究中，微流控芯片被連接到壓力控制器，以對細胞施加周期性壓力和壓力，就像它們在肺中所經歷的那樣。換句話說，微流控芯片可以成為自己的微型生物反應器，從而獲得我們已經討論過的生物反應器為3D細胞培養提供的許多好處。與此同時，具有集成傳感器的微流控技術正在開發中，并且很可能在不久的將來變得更加普遍。傳感器的存在，就像在生物反應器中一樣，能夠監測重要的變量，并促進自動化和可追蹤性。
微流體實現的自動化、小型化和精確化也將有助于標準化細胞分化等敏感程序。事實上，需要分化的細胞，如干細胞或單核細胞，通常使用常規的宏觀體外實驗程序進行分化，如果不控制化學和環境刺激，這種方法可能容易出現很大的變異。相比之下，微流控芯片可以精確控制培養液中營養物質的輸送，或氧氣濃度或流體性質，所有這些都已被證明影響干細胞分化。同時，將這些芯片與蛋白質分析等傳感器相結合，可以解開特定信號和信號通路在細胞分化過程中的作用。

微流控技術促進的小型化和自動化最終提供了將繁瑣的程序從科學中心分散到更偏遠地區的可能性。這已經被用于檢測肝功能的微流體。相比之下，微流控應用于3D細胞培養目前需要許多步驟，而這些步驟只能在實驗室中進行。然而，隨著正在進行的發展，3D細胞培養微流控也可能成為直接用于臨床的臨床點診斷方法，即使不是在偏遠地區。
獨一無二的是，微流控芯片能夠對血管結構進行灌流。簡而言之，當內皮細胞混合在適當的3D凝膠(如纖維蛋白)中時，它們就會形成血管。雖然這可以以任何形式發生，但微流控芯片中的血管形成直接連接到微流控通道的開口。這意味著人們可以通過微流體通道直接接觸到血管的血管內隔間，從而使血管可以被顆粒、細胞或介質灌流。這對于重建許多涉及細胞或分子在血管系統內運輸的生物過程，或者僅僅是能夠在血管系統內灌流藥物，就像它們將在患者體內輸送一樣，是至關重要的。另一方面，有機類化合物也可以在微流控芯片中生長，以更好地控制它們的發展。也就是說，微流體室將在一定程度上限制并控制有機物的形狀和大小。最終，有機化合物可以與微流控芯片中的血管網絡混合，獲得可灌流的器官模型，并獲得更復雜的組織模型。最終，在微流控芯片中結合干細胞/有機體意味著能夠使用患者來源的細胞來創建個性化的細胞模型。
同時，微流控系統特別適合免疫細胞的研究，正如在其他地方廣泛回顧的那樣。這是因為它們允許建立細胞因子梯度，這是免疫細胞的重要指導信號。微流體模型提供的流量控制對于重建血液循環中的免疫細胞傳輸至關重要。同樣，前面討論的在微流控芯片上灌流血管的能力也特別有助于重建免疫細胞在血管內和血管間的運輸，就像它們在體內所做的那樣。最后，免疫細胞是高度流動性和異質性的細胞，這必須經常被視作研究它們的一種手段。微芯片極大地方便了他們進行詳細分析的高分辨率成像。
最后，微芯片一直是芯片器官騰飛努力背后的唯一技術。正如我們之前所討論的，微芯片提供的對微環境的更多控制使得這項技術成為開發有機模式的獨特技術。此外，流動的促進使所述器官之間能夠連接和相互作用，以及分子從一個器官到另一個器官的運輸。這些相互作用已被證明是藥物測試的關鍵。例如，腸道和肝臟被結合在芯片上，因為藥物首先通過腸道吸收，然后由肝臟代謝。它們的結合已經被證明對藥物命運的影響不同于單獨培養腸道肝臟的芯片。在芯片上添加胃可能對模擬胃排空也很重要，所有這些都會影響藥物的藥代動力學。最終，人們可以想象一種芯片上的身體產品，其中基本的器官型組織通過可灌流的血管系統相互連接，以測試人體對藥物的全身反應。
最近，研究人員首次在芯片上以3D生物打印心臟：這顯示出促進和標準化芯片上器官制造的巨大希望。此外，軟應變傳感器被集成到組織的微體系結構中，為芯片上的儀器器官鋪平了道路。
總而言之，我們相信，如果有真正的努力將其潛力從學術環境轉化為臨床世界，微流控技術將為3D細胞培養領域提供很大的幫助。最有可能的是，解決方案不僅將借鑒微流控技術，還將借鑒水凝膠和生物反應器技術的進步，最終融入一個協同領域。然而，所有這些都需要工程師、生物學家、臨床醫生、衛生監管機構…之間的共同努力。所以，讓我們一起努力吧！