病原微生物的快速檢測對疫情的預防控制至關重要?；?/span> PCR 的病原微生物核酸檢測方法克服了傳統病原微生物培養方法耗時長、免疫學檢測存在窗口期等問題。然而，對精確控溫熱循環儀的依賴卻嚴重限制了其在資源匱乏地區的應用。雖然基于核酸等溫擴增的病原微生物檢測方法可擺脫對高精度溫控設備的依賴，但仍需要進行樣本核酸分離提取、擴增與檢測等步驟。近年來，微流控技術與核酸等溫擴增技術相結合，誕生了多種病原微生物等溫擴增微流控檢測技術。該技術通過設計芯片結構、優化進樣模式及檢測方式，實現了病原微生物核酸提取、擴增與檢測一體化，并具備多重檢測、定量檢測等功能，具有對儀器依賴度小、對操作人員要求不高、樣本量需求小和自動化程度高等優點，適合于在多種環境下的病原微生物快速檢測。

基于重組酶聚合酶擴增的病原微生物微流控檢測技術

2006 年，Piepenburg等[1]首次提出了重組酶聚合酶擴增反應(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重組酶(T4uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物參與的等溫擴增。首先，T4 uvsX 在輔助因子 uvsY的作用下與引物結合形成核酸蛋白復合物，然后該復合物尋找與靶標 DNA 的互補區域進行雜交并置換下另一條單鏈，置換下的單鏈馬上被 gp32結合防止其再與互補鏈雜交，最后 T4 uvsX 在 ATP 的作用下與引物解離，聚合酶 Bsu 與引物結合并沿模板進行延伸(圖 1)。該反應在37~42℃下 30 min 內可以獲得1012拷貝的擴增產物，其靈敏度可達到單拷貝，其擴增產物長度在500 bp 以內最佳[1]。由于RPA反應快速、靈敏以及恒溫條件溫和等特點，因此易于與微流控芯片結合開發出對病原微生物的即時檢測(point-of-care testing,POCT)技術。

圖1 重組酶聚合酶擴增反應基本原理

Fig. 1 Principle of recombinase polymerase amplification

1：在重組酶作用下，引物與靶序列結合；2：引物與靶序列結合后置換下的單鏈被單鏈結合蛋白結合；3：在聚合酶作用下進行延伸，同時置換下的單鏈被單鏈結合蛋白結合；4：同源雙鏈分離，持續延伸；5：形成新的雙鏈，并進行下一個循環。

基于環介導等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi 等[2]于2000 年首次發表，該反應原理如圖 2 所示。針對待測靶標設計一對外引物F3、B3 和一對內引物FIP、BIP，在具有鏈置換活性的DNA 聚合酶(Bst DNA 聚合酶)作用下，引物沿模板發生延伸和鏈置換反應，產生長短不一的靶標重復片段，該反應通常在60~65℃進行，1 h 內將待測靶標擴增109倍以上，靈敏度可達到檢測 10 拷貝的待測靶標。通過額外引入一對環狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并使反應時間縮短至 30 min 內。鑒于 LAMP 靈敏度高、檢測方式多樣、反應速度快等優點，近年來發展了很多LAMP 微流控芯片，它們在進樣方式、產物檢測方法等方面各有千秋，在病原微生物核酸檢測方面均具有較好的應用前景。

圖 2環介導等溫擴增原理

Fig. 2 Principle of loop-mediated isothermal amplification

A：LAMP外引物F3/B3 和內引物FIP/BIP 與靶標互補的6 個區域，如其中F3 與F3c 互補，B3 與B3c互補；B：起始結構產物生成步驟，引物FIP 通過F2 區域與模板鏈F2c 結合并進行延伸，之后F3 與靶標F3c 結合并進行鏈置換反應，FIP延伸產物被替換釋放，釋放的單鏈末端形成環結構(結構3)。BIP 和B3 以相似的方式進行，生成兩端具有環結構的產物5。C：循環放大步驟，結構5以自身為模板，從3’末端F1 區域開始自引發DNA 合成，同時FIP 退火至環狀結構中的F2c 區域并進行延伸得到結構6。結構6以自身為模板延伸，置換下與結構5 互補的產物7。結構7 到結構8 再到結構5 與結構5 到結構6 再到結構7 類似。結構9 和結構10分別由結構6 和結構8 生成。在環狀結構與FIP/BIP 引物的共同作用下生成含有多個重復靶標序列的結構11、12。

基于其他核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術

 基于滾環擴增的病原微生物微流控檢測技術

滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)是一種具有鏈置換活性DNA 聚合酶催化的等溫擴增反應，需要一條鎖式探針與靶序列雜交后連接成環狀模板，引物與環狀模板匹配后在DNA 聚合酶作用下沿環延伸并不斷置換先前產生的延伸鏈，最終產生重復的長單鏈DNA 產物(圖 3A)。在RCA 基礎上通過引入與延伸產物退火雜交的另一條或多條引物可形成超分支RCA，實現超指數式擴增；或通過偶聯RCA 與核酸侵入反應實現低成本、高靈敏、高特異性的信號放大核酸檢測。Jiang 等開發了一款RCA 芯片，其通道內修飾的適配體可捕獲病原微生物，再通過另一適配體引物與菌體結合形成“三明治”結構，利用適配體引物引發RCA 反應進行信號放大，最后通過熒光探針的雜交進行檢測(圖 3B)，該方法可檢測102個細胞/mL 的E. coli O157:H7。但由于RCA 需要鎖式探針首先與靶標連接成環，連接與擴增步驟一般不在同一體系進行，因此較難開發集提取、擴增和檢測于一體的RCA 微流控芯片。

圖3 RCA 反應原理及微流控芯片

Fig. 3 Principles of RCA and the microfluidic chip

A：RCA擴增原理，環狀模板兩端與連接模板退火，并進行連接，使模板成環，之后引物與環狀模板退火后經DNA聚合酶進行延伸，最終可得到一條含有多個重復模板序列的長DNA 單鏈。B：RCA微流控芯片，在微流控內壁修飾由適配體，可將大腸桿菌特異性捕獲。適配體-引物復合體與被捕獲的大腸桿菌結合，引物以環狀DNA為模板進行延伸，通過熒光探針對延伸產物進行檢測。

基于依賴核酸序列擴增的病原微生物微流控檢測技術

1991年，加拿大Cangene Corporation 公司Jean Compton 實驗室首次提出依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。該方法以單鏈RNA 為模板，在恒溫條件下，通過逆轉錄酶、RNase H和T7 RNA 聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內逆轉錄病毒的復制機制對目標RNA 進行擴增(圖 4A)，90min 內可以將靶標擴增至1012，其產物長度為 100~250 bp，靈敏度可達檢測單個拷貝的靶標分子。Wang 等發展了一種可以進行數字化檢測的 NASBA芯片(dNASBA)，如圖 4B所示，沿芯片主通道分布多個獨立小室，小室最末端伸出分支通道與主通道相通。首先通入油相排除芯片腔體內的空氣，進樣口加入水相體系并在出樣口連接負壓，基于流體的固有性質及芯片結構，液體會經主通道自動填充至每個分離的小室，但不會進入分支通道，再加入油相填充主通道使每個小室體系隔離，完成反應體系的數字化分布。然而，NASBA擴增步驟多，反應體系較復雜，不易開發成微流控檢測芯片，因此基于NASBA 的病原微生物檢測芯片鮮有報道。

圖4 NASBA 反應原理及微流控芯片

Fig. 4 Principles of NASBA and the microfluidic chip

A：NASBA 擴增原理，含有T7 序列的引物1 與靶RNA雜交，進行逆轉錄生成DNA，加Rnase 使RNA 降解，并加入引物2 與DNA 雜交延伸，生成雙鏈DNA。由雙鏈DNA 經T7 RNA聚合酶進行轉錄生成RNA。然后進行循環。最終生成大量RNA 經熒光探針進行檢測。B：NASBA數字化微流控芯片，首先在干凈的芯片通入油相填充真個芯片，再加入反應體系，使反應體系填充至每個小室。由于小室底部通道疏水，因此并不會經小室底部的通道流出。最后再通油相封閉主通道，使每個小室獨立分隔。形成數字化液滴芯片。

基于解旋酶依賴性擴增的病原微生物微流控檢測技術

在體內，DNA 通過解旋酶、DNA 聚合酶及各種輔助蛋白因子進行復制，Vincent 等模仿這一過程開發出了體外解旋酶依賴性擴增法(helicase-dependent amplification, HDA)。該方法原理如圖 5A 所示，首先DNA 雙鏈被DNA 解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)結合，之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交，在DNA 聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸，合成新的雙鏈，在37℃ 條件下反應1~2 h 可獲得106倍的擴增產物，其靶序列在400 bp 范圍內可以得到有效擴增。Mahalanabis 等開發了一種μSPE-HDA 芯片，可直接將樣本裂解液注入芯片進樣孔，流經芯片內置的固相萃取色譜柱，之后進行洗滌洗脫完成DNA 的提取，再將提取的 DNA 和 HDA 反應體系直接注入混合室，經混勻后進入反應室(整個過程通過瓣閥控制廢液、洗脫液和體系的流向) (圖 5B)。然而，HDA 反應體系復雜，反應過程難以控制，給基于 HDA 的微流控芯片設計帶來了困難。

圖5. HDA 反應原理及微流控芯片

Fig. 5 Principles of HDA and the microfluidic chip

A：HDA擴增原理，首先雙鏈DNA 經解旋酶解旋，單鏈被單鏈結合蛋白結合。引物與單鏈特異性雜交后經聚合酶延伸，最后形成新的雙鏈；B：HDA微流控芯片，芯片內置SPE 提取柱、反應單元、廢液池，各位置開關閥門可控制液體流向。反應末端為疏水出氣孔，可在滿足進樣的同時防止液體流出。各種核酸等溫擴增技術在反應體系組成、反應條件、檢測方式等方面均各有優劣(表1)，但它們依然離不開核酸提取、擴增與產物分析等步驟，如何簡化與集成這些繁瑣操作步驟成為病原微生物核酸現場快速檢測的關鍵[3]。而構建集病原微生物預處理、核酸提取、擴增與檢測于一體的等溫擴增芯片是未來的發展方向，并且為了發展適用于極端惡劣環境的病原微生物POCT芯片，如何降低對儀器設備的依賴性、增強芯片及反應體系的穩定性、提高檢測的特異性與定量性能始終是等溫擴增病原微生物檢測芯片需要克服的技術瓶頸。相信隨著微流控技術與核酸等溫擴增檢測技術的發展，會出現定量性能更好、儀器依賴度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等溫擴增病原微生物檢測芯片技術，使病原微生物即時檢測向著集成化、快速、高通量、多重篩查的方向發展。

表 1  不同核酸等溫擴增技術比較

Table 1 Summary and comparison of different nucleic acid isothermal amplification methods