分享一篇2017年2月的PNAS，來自斯坦福大學醫學院的工作，超低成本的稀有細胞分離富集微流控芯片，充滿了工程學的解決問題思路，我覺得是很出色的工作。

稀有細胞（rare cells）是指含量<100個細胞/毫升全血的細胞，這些細胞在血液和組織中含量非常少，例如干細胞、循環內皮細胞、循環腫瘤細胞核殘留病變細胞。分離檢測稀有細胞對于重大疾病的早期診斷有非常重要的作用，例如瘧疾、肺結核、艾滋病和癌癥，這些致命疾病如果能通過對稀有細胞的分析完成早期診斷，控制病情乃至治愈的可能性將大大提高，減少病患痛苦，減輕醫療負擔。

要實現這一目的，就要求從復雜的血液體系中快速準確地分離出我們想要檢測的少量目的細胞并進行分類處理、純化或富集。目前常用的實驗室分析通常需要對目的細胞進行標記，引入外來標記分子以增強檢出敏感度，但是這種手段可能會使得后續純化步驟非常復雜，而且標記物有可能影響細胞原有性質。非常復雜，耗時耗力，花費也很高。

近些年非常熱門的芯片實驗室（lab on a chip, LOC）概念或許能解決這一困難。LOC指的是將一系列實驗室操作集成到一個非常小的芯片上，只需極少量（微升甚至納升級別）液體樣品，就可以在生物芯片上自動完成操控分析。在許許多多的實驗室分析技術當中，電動力學相關的技術尤其適合在芯片上實現，因為電場的方向、頻率、振幅等參數都很容易精確控制，而且電泳、電滲、滲透電泳、毛細滲透等原理在生化分析方面有非常廣泛而重要的應用。利用各向異性電場誘導受試樣品（血細胞、腫瘤細胞、血小板、蛋白質、DNA分子等等）產生電偶極矩，就可以將不同性質的生物樣品分離開，而且通過操控電場實現的生物樣品分析不需要引入外來標記物，避免了標記可能帶來的問題。

LOC技術具有的快速、準確、無外來標記物等特點使其非常適合與即時檢測（point of care testing, POC testing）相結合，然而目前仍少有這方面的研究報道。即時檢測，又稱床邊檢測，顧名思義指的是就近、簡便、迅速的檢測手段。能夠短時間在患者身邊進行簡單的檢查和診斷，有利于醫生和護士進行迅速處理。患者也可以在家自行使用POC設備，就可以方便對慢性疾病的持續性檢查。而在醫療條件仍比較落后的發展中國家和地區，POC檢測對于上文提到的瘧疾、HIV、腫瘤等致命疾病的早期診斷具有非常重要的作用，而盡早診斷并介入治療可有效提高病患存活率并降低醫療支出，因此開發低成本的POC檢測設備對于發展中國家和地區醫療具有重要意義，這也正是這一工作的研究目標。

這一工作的主要內容是將LOC技術應用于POC檢測，制造超低成本、一次性可拋棄的生物芯片，用于稀有細胞的分離與富集，以發展快速、便捷、廉價的重大疾病早期檢測方案。

這一工作設計的微流控納米噴墨電子檢測平臺為多層堆疊結構，下層是具有微孔結構的PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯，polyethylene terephthalate）柔性高分子薄膜，表面由可導電納米粒子噴印形成電路結構；上層是PDMS（聚二甲基硅氧烷，polydimethylsiloxane）微流控芯片；中間層是絕緣薄膜，用于分隔開微流控芯片和電路結構，圖1所示即為平臺裝置示意圖。噴墨打印的分辨率可達20微米，整個平臺設備成本只需1美分，約20min即可制作完成。

圖1. 微流控納米噴墨電子檢測平臺設計示意圖 A)用噴墨打印機將含導電納米顆粒的“墨水”噴印在PET底物薄膜上形成電路；B）1. PET柔性電路板；2. 粘附在絕緣膜上的PDMS微流控芯片

在這一平臺中，絕緣層和微流控芯片為一次性使用后即可拋棄的，而PET柔性電路板可回收并重復使用，同時開發者可以通過開源軟件自主設計電路，使這個平臺擁有非常高的擴展性，可實現各類檢測目標，圖2為實物圖。這種使用微流控芯片的檢測方式不需要任何標記物，即可實現高通量檢測。 

圖2. D)檢測平臺實物圖 F) PET柔性電路板實物圖

為了驗證噴墨微流控測試平臺的作用，將不同尺寸（直徑5微米和10微米）的PS（聚苯乙烯，polystyrene）微球表面包覆上鏈霉親和素，制成PMS微球以模擬細胞，這種微球的大小和形狀都與細胞相類似，同時實驗還用到了酵母細胞和乳腺癌腫瘤細胞株（MDA-MB-231），以檢驗該平臺在含有多種細胞的非均相體系中的作用。

通過微流控芯片設計以及柔性電路板可控電場的作用，這一裝置可以實現的功能有：

（1）從多元體系中限制住單個生物粒子

如圖3.A所示為平臺示意圖，底下三條橫杠是PET柔性電路板上的電極，上面一塊半透明的即為PDMS微流控芯片，中央是一道微流控管道。在低電場強度的條件下，微流控管道中間將形成電勢阱（圖3.B 電勢分布曲線中間最低點），如果沒有外來施加的能量，生物粒子無法偏離電勢最低處。從圖3.C的微流控芯片三維電勢圖可以清楚看到，芯片表面電勢如山巒起伏，橫向貫穿的管道中電勢較低如山谷，而管道縱橫交匯處三個深藍色的坑，就是勢能最低點，即為足以限制住生物粒子的勢阱。從顯微照相圖（圖3.D）中也可以看到，PMS微球被限制在設計好的陷阱中動彈不得。（說實話他不圈出來我肯定看不出那里停了個球）

圖3. 多元復雜體系中單個生物粒子限制功能 A)微流控芯片示意圖；B)微流控管道內電勢分布；C)三維電勢圖；D)顯微照相圖

（2）在不需要標記物的情況下實現細胞選擇性分析分類并分離出想要的細胞

同樣圖4.A所畫的是這一裝置的示意圖，在分離分析細胞這一功能中，微流控管道的形狀與之前有所不同，為三叉戟（嗯？）的形狀，由于不同生物粒子在電場極化后帶有不同的偶極矩，它們在電場中的行為也會不同，憑借這一特點，它們將在微流控管道的岔路口分道揚鑣，實現分類分析的功能。將管道中電勢分布畫出來即如圖4.B、4.C所示，在管道的偏左偏右有兩條勢能非常高的區域，橫截面的電勢分布即為圖4.D，與圖4.C相符。在熒光顯微（圖4.E左）和明場照相（圖4.E右）中可以觀察到，乳腺癌細胞和酵母細胞會流向帶負電的區域，而PMS微球全部聚集在右邊帶正電的區域，分離效果比較好。

圖4. 無標記物分類分離細胞功能A)微流控芯片示意圖；B)微流控管道內電勢分布計算圖；C)電勢分布局部放大；D)橫截面電勢分布圖；E)顯微照相圖

（3）稀有細胞濃縮富集，也并不需要標記物

電極設計示意圖如圖5.A，在電極組成的十字路口，四周的電勢是不同的，因此十字路口斜對角電勢分布如圖5.B所示，在唯一一塊帶正電的電極附近達到了最高值。因此可以確定，帶負電的細胞只能富集在此處。源源不斷的細胞流向此處，只能在這里停留，也就實現了濃縮，圖5.C和5.D中就可以看到，乳腺癌細胞全部聚集在十字路口的這一頭。如果我們改一改電極所帶的電荷情況，比如說改成圖5.E這樣，富集區域就會跟著改變（圖5.F&5.G）。

在圖中橙色虛線為電極邊緣，藍色虛線為微流控管道邊界。熒光疊加的細胞軌跡圖中，紅色為細胞，藍色為大量細胞聚集區域。

圖5. 稀有細胞濃縮富集 A)微流控芯片示意圖；B)電勢分布圖；C)熒光顯微照片觀察到細胞富集；D)細胞軌跡疊加；E)改變電極帶電情況；F)改變電場后富集區域改變；G)細胞軌跡疊加

（4）實時單細胞計數

這一功能的電極設計也非常巧妙，在微流控管道兩側，前后有兩對矩形電極，而中間的電極是兩塊相對的三角形（圖6.A），當單個細胞通過此處時，電場將發生變化，借此電信號即可實現細胞計數。如圖6.B即為單個細胞通過三角形電極中間管道時的顯微照片。此時這一平臺的橫截面電路可以等效簡化為圖6.C，灰色平臺上紅色的兩側電極形成了一個電容器，粉色的絕緣層也是電容，微流控芯片和液體帶有電阻R，而實時通過的單個細胞電阻為△R，將電場線畫出來就可以得到6.D圖。實驗中用到的電源為12V 900千赫茲的交流電，當單個細胞通過時，電極兩側電壓，也就是電容器兩端的電壓有明顯的降低，如圖E所示，就是有6個PMS微球逐一通過的電勢圖，可以看到明顯的6個峰。

圖6. 實時單細胞計數 A)微流控芯片示意圖；B)單個細胞通過電極顯微照相圖；C)等效電路圖；D)單個細胞通過的電勢計算圖；E)6個PMS微球通過的實驗測量電勢圖

這篇文章還完成了一些其他工作，例如確保生物芯片對細胞沒有毒性，畢竟我們不希望一頓操作猛如虎，最后分析了一堆死細胞；調整液體在管道中的流速、電場的最適強度和頻率等等。然而真正使這一工作稱得上是芯片實驗室（LOC）的，我覺得是，以上所有功能可以集成在同一片微流控芯片上（圖7）。

圖7. 全功能微流控納米噴墨電子檢測平臺示意圖

在不同區域可以實現上述各種功能，這樣一來整個流程就是：加入一滴（微升到納升級別）液體樣本，經過（a）分選艙，不同細胞分開，我們不關心的部分就從（b）排出，而我們想要檢測的細胞由于電勢阱被限制在（c）處等待收割。如果稀有細胞量太少了，那就送到（d）富集一下，對于我們想計數的細胞，在通過（e）之前注射一些磷酸緩沖液（PBS）稀釋一下，然后一個個計數。要是想分析多種細胞？送到下一個岔路口再來一次。

只用了你一滴血而已。

柔性PET電路甚至是開源設計的，研究人員和醫生可以交流設計方案、免費下載可靠的電路圖、花20分鐘用噴墨打印機打印下來。在可能的應用場景中，醫生從兜里掏出一把塑料紙，挑挑揀揀抽出一張PET電路板，再從另一個口袋里拿出滅菌封裝好、隨取隨用的微流控芯片，撕開包裝擺在電路板上。扎你中指取血是免不了的了，你還在那兒齜牙咧嘴疼呢，醫生反手一個毛細管吸上100微升血樣已經加到芯片上了。過不了多久，醫生就能拿到足量的稀有細胞進行下一步檢查。PDMS芯片隨手就扔了，PET電路板繼續揣兜里。

原文：Esfandyarpour, R., et al. (2017). "Multifunctional, inexpensive, and reusable nanoparticle-printed biochip for cell manipulation and diagnosis." Proc Natl Acad Sci U S A 114(8): E1306-E1315.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28167769/

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