人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一組雙鏈DNA病毒，屬多瘤空泡病毒科，約由8000個堿基對構(gòu)成。目前已有超過200種HPV型別，并且各項研究不斷的發(fā)現(xiàn)新的HPV型別。HPV與多種皮膚黏膜疾病相關(guān)，其中包括良性和惡性的增生病變皮膚型HPV大部分為Beta屬，小部分屬Alpha屬、Gamma屬、Mu屬和Nu屬。可引起數(shù)種皮膚型疾病，例如良性皮膚疣，日光性角化病(AKs)和非黑素瘤皮膚癌(NMSCs)。在健康人的皮膚上也常常檢出皮膚HPV型別。皮膚型HPV感染中最常見的疾病即為皮膚疣類疾病，可分為尋常疣、跖疣和扁平疣這三大類，不同的HPV型別感染可導(dǎo)致不同的皮膚疣疾病的發(fā)生。尋常疣多由HPVl、2、4型感染引起，HPV2型別可能是引起人群手、足尋常疣的最常見型別。扁平疣則多由HPV3、10、28引起。且不同的HPV型別引起的皮膚疣臨床表現(xiàn)都略有不同，例如角化程度的不同。且HPV的感染具有顯著的地域差異，通過對本地區(qū)患者HPV感染型別的檢測，結(jié)合對治療效果的分析，從而對推動皮膚疣個體化治療方案的實施提供分子流行病學(xué)依據(jù)。但是目前絕大部分的HPV檢測方法是針對黏膜型HPV，缺乏一種成熟的可應(yīng)用于臨床的皮膚型HPV檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是一種可在恒溫條件下擴增DNA的技術(shù)，反應(yīng)過程為4套特異性引物特異性結(jié)合目標(biāo)DNA的6個位點，并由BstDNA聚合酶催化自動擴增鏈置換DNA。該技術(shù)有著耗時少、花費低以及不需專業(yè)儀器等優(yōu)點，與其他DNA擴增方法相比，有著明顯的優(yōu)勢。也因此，LAMP技術(shù)常作為一個低成本基因分析工具被用于資源貧乏地區(qū)。LAMP方法的敏感性并不會因為樣本中非目標(biāo)DNA的存在而受到影響，因此該方法的應(yīng)用范圍也較PCR更為廣泛。更為突出的優(yōu)勢是，它的敏感性與特異性均要高于PCR很爹，由于LAMP反應(yīng)中引物必須結(jié)合目標(biāo)DNA的6個特異性位點，該方法的特異性會明顯的高于其他檢測方法。LAMP反應(yīng)的結(jié)果判定也十分方便。在LAMP反應(yīng)過程中dNTP可釋放大量的焦磷酸鹽離子，可與反應(yīng)緩沖液中的鎂離子結(jié)合，形成白色沉淀。當(dāng)大量的白色沉淀形成后即可肉眼觀測反應(yīng)結(jié)果。在本研究中將采用加入羥基萘酚藍(lán)(HNB)進(jìn)行比色檢測，HNB作為指示劑直接加入LAMP反應(yīng)液中與M92+結(jié)合，使反應(yīng)液呈現(xiàn)紫色。在反應(yīng)過程中，由于大量不溶性焦磷酸鎂鹽的產(chǎn)生，導(dǎo)致了溶液中M92+的大量減少，溶液的顏色由紫色變?yōu)榱颂焖{(lán)色。由于這種方法觀測結(jié)果更為快速簡便，也已經(jīng)被大量運用。

LAMP已經(jīng)作為一個方便快速準(zhǔn)確的核酸擴增方法己被廣泛運用于病原檢測，如人類免疫缺陷病毒、急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒、乙肝病毒和H5禽流感病毒等。相較于其他的病原檢測方法來說，LAMP技術(shù)要準(zhǔn)確和快捷許多，但是大多數(shù)的LAMP檢測方法仍是在聚丙烯試管中進(jìn)行，反應(yīng)過程需要數(shù)十至數(shù)百微升體積的溶液，這限制了LAMP反應(yīng)的批量化和微量化，并不利于構(gòu)建完整的診斷體系。同時由于LAMP反應(yīng)的高靈敏性，也導(dǎo)致了假陽性率的增高，這也成為了LAMP技術(shù)應(yīng)用于病原檢測的一個待解決問題。

現(xiàn)微流控技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于芯片實驗室(1ab—on-chip)系統(tǒng)中，所構(gòu)成的微流控芯片可以達(dá)到在毛細(xì)通道中操控微量溶液反應(yīng)，可以在一張芯片中同時做到反應(yīng)、檢測和結(jié)果判定，構(gòu)成一個高通量、低成本的密封反應(yīng)體系。將LAMP技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合，即可得到一個微量的LAMP反應(yīng)體系，同時密封的反應(yīng)體系也大大降低了假陽性率，促進(jìn)即時(POC)病原檢測系統(tǒng)建立的實王見。

本研究旨在將LAMP反應(yīng)與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，滿足臨床中對皮膚型HPV的分型檢測需要，研究出一種實用、準(zhǔn)確、特異及靈敏的皮膚型HPV檢測方法。

主要儀器

(1) ABIStepOnerealtimePCR儀

(2)水浴鍋

(3)平板式掃描儀

(4)天能4100凝膠圖像分析系統(tǒng)

主要試劑

(1) LAMP試劑一NewEnglandBioLabs其中包括：①Bst2．0DNA聚合酶，⑦10xThermoPolreactionbuffer

(2) PCR試劑一TaKaRa公司其中包括：(DpfuDNA聚合酶(2．5U)⑦dNTP③10xpfuBuffer④SYBRGreenI

(3) 標(biāo)準(zhǔn)病毒核酸、引物合成及PCR結(jié)果測序均由華大基因提供

實驗方法

1構(gòu)建以微流控技術(shù)及LAMP反應(yīng)為基礎(chǔ)的HPV檢測方法

(1) 于http://primerexplorer.html在線LAMP引物設(shè)計網(wǎng)站進(jìn)行HPV特異性引物的設(shè)計，每型別各設(shè)計四組引物，對四組引物分別在離心管中進(jìn)行擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為25ul，分別為內(nèi)引物FIP和BIP各1．6laM，外引物F3和B3各0．2uM，dNTP1．4uM，SYBRGreenI1201．tM，BstDNA聚合酶8U，MgS048mM，10xThermoPolreactionbufie(10mMKCl，IOmM(NH4)2804，20mMTris．HCl，0．1％吐溫20，0．8M甜菜堿)，lng標(biāo)準(zhǔn)病毒核酸DNA(以下簡稱為質(zhì)粒DNA)。同時設(shè)置四組陰性對照，將上述反應(yīng)體系中質(zhì)粒DNA用ddH20代替。將離心管放入熒光PCR中反應(yīng)，設(shè)置溫度為60℃，反應(yīng)60min。觀察每組引物的擴增效率，篩選擴增效率較好的引物。

(2) 檢測30種HPV型別相互間特異性，實驗用微流控芯片有8個反應(yīng)孔，每一實驗均有陽性對照組以及至少一個陰性對照組，將30個型別按照高危型和低危型分為皮膚低危型別組、皮膚高危型別組及皮膚罕見型別組，每6個型別為一小組，皮膚低危型別組由3個小組組成，皮膚高危型別及皮膚罕見型別各1個小組(見表1)，特異性驗證在各組內(nèi)進(jìn)行，保證每小組內(nèi)各HPV型別之間特異性較好的基礎(chǔ)上，盡量保證小組組間特異性，并將小組組間交叉反應(yīng)型別控制到最小。首先在利用離心管進(jìn)行LAMP反應(yīng)，篩選特異性佳的引物，反應(yīng)體系為25ul，除了用HNB取代SYBRGreenI之外，反應(yīng)體系同上，水浴60℃反應(yīng)60min，直接觀測顏色變化判斷試驗結(jié)果，陽性結(jié)果為天藍(lán)色，陰性結(jié)果為紫羅蘭色。30種HPV型別引物篩選完成后，在微流控芯片中重復(fù)試驗，驗證結(jié)果，芯片中加入待驗證型別引物O．8ul，陽性對照組為反應(yīng)體系中的質(zhì)粒HPV型別引物，陰性對照組為空，自然風(fēng)干后，注入無引物L(fēng)AMP反應(yīng)液(751．1l，反應(yīng)體系同上)，水浴60。C反應(yīng)60min，直接觀測顏色變化判斷試驗結(jié)果，陽性結(jié)果為天藍(lán)色，陰性結(jié)果為紫羅蘭色。

表130種HPV型別具體分組

(3) 檢測各型別引物的靈敏性，將各型別HPVDNA質(zhì)粒溶液分級稀釋為108copies／lal，107copies／ul，106copies／lal。使用微流控芯片進(jìn)行實驗，芯片中加入6種待驗證型別引物0．8ul，剩余兩孔為空，設(shè)置為陰性對照組，注入無引物L(fēng)AMP反應(yīng)液，反應(yīng)體系為75ul，體系中加入待檢測的6種HPV型別質(zhì)粒DNA各3ng，其余同上，60。C水浴反應(yīng)60min，直接觀察顏色判斷試驗結(jié)果，陽性結(jié)果為天藍(lán)色，陰性結(jié)果為紫羅蘭色。

2評價新構(gòu)建HPV檢測體系

(1) 使用新構(gòu)建方法檢測皮膚疣臨床樣本型別。樣本來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診皮膚疣病人，使用低危型別組芯片進(jìn)行檢測，LAMP反應(yīng)體系中加入臨床樣本DNA3ng，反應(yīng)體系同上，60。C水浴反應(yīng)60min，直接觀察顏色判斷試驗結(jié)果，陽性結(jié)果為天藍(lán)色，陰性結(jié)果為紫羅蘭色。

(2) 使用PCR方法檢測同一批臨床樣本HPV型別，使用皮膚型HPV通用引物FAP6085／64，反應(yīng)體系為25ul，分別為10×pfuBuffer2．5ul，dNTP0．2laM，pfuDNA聚合酶5U，F(xiàn)AP6085／64引物溶液各6．4mM，質(zhì)粒DNA2ng，PCR條件：95。C預(yù)加熱5min之后，94。C保持50s，49。C保持50s，72。C保持50s，進(jìn)行60個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物加入10％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，并將剩余PCR產(chǎn)物送出測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對后，確定HPV具體型別。

(3) )將兩種檢測方法結(jié)果進(jìn)行比對，以PCR測序法作為黃金標(biāo)準(zhǔn)，評價新構(gòu)建的檢測方法的特異性和靈敏性。

結(jié)果

1．引物篩選

每HPV型別各設(shè)計4組引物，選取在30個循環(huán)數(shù)內(nèi)擴增且無非特異性擴增的引物進(jìn)入下一步的特異性檢測(如圖1)，篩選結(jié)果示各型別均有多組引物符合引物篩選要求。

圖1HPVl引物擴增曲線

圖中1線代表HPVl型別第一組引物擴增曲線。2線代表HPVI型別第二組引物擴增曲線。3線代表HPVl型別第三組引物擴增曲線。4線代表HPVI型別第四組引物擴增曲線。5線代表無質(zhì)粒DNA的陰性對照組。

2．特異性檢測

5個小組組內(nèi)HPV型別均無交叉反應(yīng)出現(xiàn)，特異性佳(見圖，2、3、4)，皮膚低危型別中3個小組間特異性檢測結(jié)果(見圖5)，其中HPV2引物可被HPV3質(zhì)粒DNA擴增，HPV3引物可被HPVl25質(zhì)粒DNA擴增，HPV75引物可被HPV76質(zhì)粒DNA所擴增(見表2)，其余皮膚低危組HPV型別小組間均無交叉反應(yīng)，特應(yīng)性佳。

圖2皮膚低危型別中3小組組內(nèi)特異性檢測

圖5皮膚低危型別中3小組組問特異性檢測

圖中A代表l小組與2、3小組間特異性檢測，B代表2小組與l、3小組問特異性檢舅，C代表3小組與l、2小組問特異性檢測。

表2皮膚低危型別組內(nèi)出現(xiàn)交叉反應(yīng)的HPV型別

3.靈敏性檢測

30種HPV型別引物均在質(zhì)粒DNA溶液濃度為107copies／ill時產(chǎn)生擴增反應(yīng)，出現(xiàn)陽性結(jié)果(見圖6、7、8)，可以得出該檢測體系的靈敏性為可檢測的病毒DNA濃度最低達(dá)107copies]lil．具體引物序列見表3．

圖6皮膚低危型別組3個小組I-IPV型別靈t性檢舅

圈中A代表I小組靈t性檢測，B代衰2小組靈t性檢測．C代衰3小姐更t性檢一。

圖7皮膚高危型別組HPV型別靈敏性檢測

圖8皮膚罕見型別組I-IPV型別靈敏性檢測

本檢測方法操作簡單，不需專業(yè)技術(shù)人員即可操作，需要的儀器簡單，普通水浴鍋即可，加上微流控反應(yīng)體系和高通量反應(yīng)的特點，大大降低了臨床檢測的成本，節(jié)約了臨床檢測時間，短時間內(nèi)(60min)即可目測出結(jié)果，且檢測的靈敏性及特異性均高，可進(jìn)行臨床大規(guī)模樣本檢測，同時適用于研究HPV感染的流行病學(xué)和正常人的HPV感染篩查。本課題只檢測了85例臨床樣本，仍需大量臨床樣本檢測數(shù)據(jù)，完善數(shù)據(jù)分析，結(jié)合臨床上治療方法的治療效果，分析各治療方法對感染不同HPV型別的病例的治療效果，從而達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)療的目的，同時通過檢測HPV感染型別的具體類型，可輔助判斷疾病的良惡性，對疾病的診斷及預(yù)后判斷有著極大的幫助，另一方面，通過對本地區(qū)的HPV感染的流行病學(xué)調(diào)查，為研制特異性的HPV病毒基因預(yù)防性疫苗提供了可靠的分子流行病學(xué)依據(jù)。

本課題新構(gòu)建的皮膚型HPV檢測體系初步構(gòu)建完成，該體系具有高靈敏性及高特異性的特點，結(jié)合其低成本、高通量及操作快速簡單的特點，滿足了臨床檢測的需要，彌補了皮膚型HPV檢測這一領(lǐng)域的空白。

（文章來源：中國醫(yī)科大學(xué)作者葛格節(jié)選部分文章科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）