資料來源：遺傳, 2019, 41(7): 611-624 doi: 10.16288/j.yczz.19-051

病原微生物的快速檢測對疫情的預防控制至關重要。近年來,微流控技術與核酸等溫擴增技術相結合,誕生了多種病原微生物等溫擴增微流控檢測技術。該技術實現了病原微生物核酸提取、擴增與檢測一體化,并具備多重檢測、定量檢測等功能,具有對儀器依賴度小、對操作人員要求不高、樣本量需求小和自動化程度高等優點,適合于在多種環境下的病原微生物快速檢測。本文將對目前基于核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術進行簡述，以期為病原微生物的快速篩查提供更多的方案思路。

一、基于重組酶聚合酶擴增的病原微生物微流控檢測技術

2006年,Piepenburg等首次提出了重組酶聚合酶擴增反應(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重組酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物參與的等溫擴增。首先,T4 uvsX在輔助因子uvsY的作用下與引物結合形成核酸蛋白復合物,然后該復合物尋找與靶標DNA的互補區域進行雜交并置換下另一條單鏈,置換下的單鏈馬上被gp32結合防止其再與互補鏈雜交,最后T4 uvsX在ATP的作用下與引物解離,聚合酶Bsu與引物結合并沿模板進行延伸(圖1)。該反應在37~42℃下30 min內可以獲得10的12次方拷貝的擴增產物,其靈敏度可達到單拷貝,其擴增產物長度在500 bp以內最佳。對RPA產物的檢測可采用包括瓊脂糖凝膠電泳、熒光探針實時檢測、及側流層析檢測等多種方法。由于RPA反應快速、靈敏以及恒溫條件溫和等特點,因此易于與微流控芯片結合開發出對病原微生物的即時檢測(point-of-care testing, POCT)技術。

圖1   重組酶聚合酶擴增反應基本原理

1：在重組酶作用下,引物與靶序列結合;2：引物與靶序列結合后置換下的單鏈被單鏈結合蛋白結合;3：在聚合酶作用下進行延伸,同時置換下的單鏈被單鏈結合蛋白結合;4：同源雙鏈分離,持續延伸;5：形成新的雙鏈,并進行下一個循環。參考文獻[10]修改繪制。

二、基于環介導等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi等于2000年首次發表,該反應原理如圖2所示。針對待測靶標設計一對外引物F3、B3和一對內引物FIP、BIP,在具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)作用下,引物沿模板發生延伸和鏈置換反應,產生長短不一的靶標重復片段,該反應通常在60~65℃進行,1 h內將待測靶標擴增109倍以上,靈敏度可達到檢測10拷貝的待測靶標。通過額外引入一對環狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并使反應時間縮短至30 min內。其擴增產物可通過凝膠電泳、雙鏈嵌合染料、比濁法、鈣黃綠素、羥基萘酚藍、pH響應顯色、納米金可視化]等方法進行檢測。鑒于LAMP靈敏度高、檢測方式多樣、反應速度快等優點,近年來發展了很多LAMP微流控芯片,它們在進樣方式、產物檢測方法等方面各有千秋,在病原微生物核酸檢測方面均具有較好的應用前景。

圖2   環介導等溫擴增原理

A：LAMP外引物F3/B3和內引物FIP/BIP與靶標互補的6個區域,如其中F3與F3c互補,B3與B3c互補;B：起始結構產物生成步驟,引物FIP通過F2區域與模板鏈F2c結合并進行延伸,之后F3與靶標F3c結合并進行鏈置換反應,FIP延伸產物被替換釋放,釋放的單鏈末端形成環結構(結構3)。BIP和B3以相似的方式進行,生成兩端具有環結構的產物5。C：循環放大步驟,結構5以自身為模板,從3°末端F1區域開始自引發DNA合成,同時FIP退火至環狀結構中的F2c區域并進行延伸得到結構6。結構6以自身為模板延伸,置換下與結構5互補的產物7。結構7到結構8再到結構5與結構5到結構6再到結構7類似。結構9和結構10分別由結構6和結構8生成。在環狀結構與FIP/BIP引物的共同作用下生成含有多個重復靶標序列的結構11、12。

三、基于其他核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術

1、基于其他核酸等溫擴增的病原微生物微流控檢測技術

滾環擴增(rolling circle amplification, RCA)是一種具有鏈置換活性DNA聚合酶催化的等溫擴增反應,需要一條鎖式探針與靶序列雜交后連接成環狀模板,引物與環狀模板匹配后在DNA聚合酶作用下沿環延伸并不斷置換先前產生的延伸鏈,最終產生重復的長單鏈DNA產物。

2、基于依賴核酸序列擴增的病原微生物微流控檢測技術

1991年,加拿大Cangene Corporation公司Jean Compton實驗室首次提出依賴核酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。該方法以單鏈RNA為模板,在恒溫條件下,通過逆轉錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內逆轉錄病毒的復制機制對目標RNA進行擴增],90min內可以將靶標擴增至10的12次方,其產物長度為100~250 bp,靈敏度可達檢測單個拷貝的靶標分子。

3、基于解旋酶依賴性擴增的病原微生物微流控檢測技術

在體內,DNA通過解旋酶、DNA聚合酶及各種輔助蛋白因子進行復制,Vincent等[49]模仿這一過程開發出了體外解旋酶依賴性擴增法(helicase-dependent amplification, HDA)。該方法原理是首先DNA雙鏈被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)結合,之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交,在DNA聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的雙鏈,在37℃條件下反應1~2 h可獲得106倍的擴增產物,其靶序列在400 bp范圍內可以得到有效擴增。

四、不同技術比較

核酸等溫擴增技術因其反應條件溫和而倍受病原微生物檢測的青睞。雖然各種核酸等溫擴增技術在反應體系組成、反應條件、檢測方式等方面均各有優劣(表1),但它們依然離不開核酸提取、擴增與產物分析等步驟,如何簡化與集成這些繁瑣操作步驟成為病原微生物核酸現場快速檢測的關鍵。微流控芯片與核酸等溫擴增技術的結合成功解決了這一問題。

表1   不同核酸等溫擴增技術比較

相信隨著微流控技術與核酸等溫擴增檢測技術的發展,會出現定量性能更好、儀器依賴度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等溫擴增病原微生物檢測芯片技術,使病原微生物即時檢測向著集成化、快速、高通量、多重篩查的方向發展。

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