汶顥微流控毛細管電泳芯片

1.微流控芯片毛細管電泳的特點

芯片毛細管電泳技術將常規的毛細管電泳操作在芯片上進行，利用玻璃、石英或各種聚合物材料加工微米級通道，以高壓直流電場為驅動力，對樣品進 行進樣、分離及檢測。它與常規毛細管電泳的分離 原理相同，因此在分離生物大分子樣品方面具有優 勢。此外，與常規毛細管電泳系統相比，芯片毛細管電泳系統還具備分離時間短、分離效率高、系統體積 小且易實現不同操作單元的集成等優點 。芯片毛細管電泳的上述優點使其成為蛋白質分離分析中的重要手段之一。

Rodriguez等曾分別在常規毛細管、短毛細管和玻璃芯片上，以區帶電泳的分離模式，對人免疫球蛋白 G（ IgG>）和熒光素異硫氰酸酯（FITC）的反應混合物進行分離，以比較3種系統的分離性能。 使用有效分離長度為35cm的長毛細管和有效分離長度為6cm的短毛細管時，其分離時間分別為335s和84s，理論塔板數分別為27750和 41816。 當使用有效分離長度僅為2.8cm的玻璃芯片時， 分離時間縮短至16s，理論塔板數達到49000。由此可以看出采用玻璃芯片進行毛細管區帶電泳在分 離速度和柱效上明顯優于常規毛細管電泳系統。

2.微流控芯片毛細管電泳分離蛋白質的模式

目前，報道的芯片毛細管電泳分離蛋白質 主要采用區帶電泳、凝膠電泳、等電聚焦、膠束電動色譜及二維電泳等模式。

2.1芯片毛細管區帶電泳

毛細管區帶電泳是芯片毛細管電泳分離蛋白質的一種最基本的分離模式。它基于不同的蛋白質分子在電場中的遷移速率不同而實現分離，是一種簡 單、快速的分離方法。采用區帶電泳分離模式已成 功地分離了多種蛋白質樣品。

在芯片毛細管電泳分離蛋白質的研究中所要解決的一個重要問題就是通道表面對大分子蛋白質的吸附問題。蛋白質與芯片通道內壁之間的微小吸附效應就會降低蛋白質的分離效率，引起峰形變寬拖尾，影響分離的重現性。在毛細管區帶電泳分離模 式下，一般采用通道內壁永久改性和緩沖液中加入添加劑進行 動 態修飾兩種方法來抑制蛋白質的吸附。

Wu等采用多層88%水解聚丙烯醇（PVA） 修飾PDMS芯片，以區帶電泳模式有效分離了兩種堿性蛋白質（溶菌酶和核糖核酸酶）以及兩種典型的酸性蛋白質（ 牛血清白蛋白和β-乳球蛋白）。該涂層在ph3-11范圍內均可抑制電滲流的產生和蛋白的吸附作用，并且效果穩定，連續運行70次后分離效果仍然很好。該研究組隨后又采用自組裝方法在PDMS芯片通道表面加工環氧修飾的聚合物涂層抑制蛋白質的吸附，成功地分離溶菌酶和核糖核酸酶A。

Chiem等在運行緩沖液中加入了無機電解質 ,NaCI和中性表面活性劑吐溫20 來抑制蛋白質的吸附，利用芯片毛細管區帶電泳進行了單克隆抗體的分離分析。

2.2芯片毛細管凝膠電泳

在蛋白質組學和蛋白質分離研究中，凝膠電泳是廣泛使用的分離技術。它是以凝膠等聚合物作為分離介質，利用其網絡結構并依據被測組分的分子體積不同而進行分離的一種分離模式。在芯片上采用凝膠電泳模式分離蛋白質，更有利于實現分離操作的高速度和高效率。Yao等［采用十二烷基磺酸鈉（SDS）凝膠電泳分離模式，對比了芯片SDS毛 細管凝膠電泳與常規毛細管凝膠電泳系統分離蛋白質的性能，結果表明前者的分離效率明顯優于后者， 分離時間也明顯低于后者。

與常規毛細管凝膠電泳相同，芯片毛細管凝膠電泳常用的篩分介質也分為凝膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯聚丙烯酰胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介質，Herr等首次將傳統的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質的方法移植到芯片上，采用光聚合的方法在芯片通道內制備濃度為6%的交聯聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質，在30s的時間內對相對分子質量在6500~39000之間的 5種蛋白質進行分離，分離距離僅為4mm，分離效率達到理論塔板數 4.41x十的五次方。該研究組后期又在微通道內制備了濃度為 22%的交聯聚丙烯酰胺膜用于蛋白質樣品的預富集，有效富集了相對分子質量為（12000~205000）的蛋白質分子，并采用濃度為8%的交聯聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質進行分離。

在芯片毛細管凝膠電泳中，通道內壁對蛋白質的吸附仍是需要解決的重要問題。Bousse等使 聚二甲基丙烯酰胺（PDMA）物理涂覆玻璃芯片微通道內壁，將電滲流降低， 以SDS凝膠電泳的分離模式在40s內分離了bio-rad公司的蛋白質標準樣品，分離效率達到十的七次方塔板/M。Nagata在PMMA芯片中使用了PEG 涂層，以 5%線性聚丙烯酰胺為篩分介質，在分離長度為 3mm的通道內實現了胰蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白和β-半乳糖苷酶3種蛋白質的高速分離， 分離時間僅為8s。

2.3芯片等電聚焦分離

芯片等電聚焦分離蛋白質的原理與常規毛細管 等電聚焦基本相同，都是依據蛋白質的等電點（ pI） 不同而進行分離。Hofmann等首次將毛細管等電聚焦技術移植于玻璃芯片，應用于蛋白質分析。 Li等在PDMS芯片和聚碳酸酯（PC）芯片上，采用等電聚焦模式分離了牛血清白蛋白和增強型綠色熒光蛋白（EGFP）。Das等采用高聚物芯片，在等電聚焦電泳模式下優化了分離長度及電壓條件， 最終在長1.9cm的通道內于1.5min內分離了綠熒光蛋白和R藻紅蛋白，分離電壓為500V。Cui等在 PDMS芯片上采用等電聚焦分離模式成功分離了重組綠熒光蛋白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。 該作者還報道，通過改變樣品和分離介質中添加劑 甲基纖維素的濃度，可以改變完成蛋白質分離所需要的通道距離。

2.4芯片膠束電動毛細管電泳

膠束電動毛細管電泳是毛細管電泳與膠束增溶色譜相結合的分離技術，其原理是在裝有膠束溶液的通道內，溶質組分在電場力的作用下根據其在膠 束相和水相之間的分配不同而產生分離。Jin等在玻璃芯片上采用膠束電動色譜的分 離模式，以 Bio-Rad 公司的CE-SDS緩沖液作為分離介質，成功實現了相對分子質量在 14400~200000之間的8種蛋白質的分離。Doud等采用 Brij35修飾PDMS 芯片通道，在膠束電動色譜的分離模式下實現了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離。該芯片涂層在ph2~6范圍內可顯著降低蛋白質大分子的吸附， 并減少檢測蛋白質所需的沖洗時間，從而提高分離效率。Huang等在 PDMS芯片中采用0.1% 十二烷基麥芽糖（DDM）和 0.03%SDS作為混合膠束，對通道進行動態修飾，有效地抑制了蛋白質的吸附，控制了電滲流，使蛋白質在非變性條件下得到有效分離。

2.5芯片二維電泳分離

芯片毛細管電泳應用的成功促進了高速高效的 芯片二維電泳技術的發展。對于多組分的復雜蛋白 質樣品，采用傳統的一維分離方法通常無法滿足要 求，需要采用二維分離技術來提高分離效率，增加峰 容量。與傳統的毛細管電泳系統相比，在芯片上進行二維電泳分離，可以通過設計芯片通道結構實現 通道的直接交叉或連通，而無需制作復雜的二維毛細管電泳接口，從而避免了因在接口處存在死體積 而導致的譜帶擴展現象。

在芯片二維電泳分離蛋白質的研究中，第一維分離模式多采用等電聚焦模式。Chen等制作了二維毛細管電泳PDMS芯片，利用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對熒光標記的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科薩斯紅標記的卵清蛋白進行分離分析。Li等設計了等電聚焦和凝膠電泳聯用 的二維分離高聚物芯片。蛋白質樣品在完成第一維的等電聚焦分離后，可在多個并行的通道內完成第 二維的凝膠電泳分離。整個分離過程在 10min內完成，峰容量達到1700。Herr等研制了采用十字通道構型的等電聚焦,自由區帶電泳二維芯片系統，芯片通道寬200微米深20微米，待測樣品在橫向通道中進行等電聚焦分離，分離后的樣品區帶在電場驅動下進入縱向區帶電泳通道中進行第二維分離。系統采用熒光顯微鏡成像的方法對分離性能進行了評價，5min內分離的峰容量達到1300。Wang 等通過在PDMS芯片中制作微閥來防止一維等電聚焦和二維凝膠電泳系統之間的分離緩沖液相混合，在20min內有效分離了4種標準蛋白質。也有報道在PMMA 芯片上進行SDS凝膠電泳和膠束電動毛細管電泳相結合的蛋白質二維電泳分離。 該系統在12min內完成10種蛋白質的分離，峰容量約為1000。

2.6芯片自由流電泳

除上述分離模式外，芯片自由流電泳也是芯片電泳分離蛋白質的重要方法。芯片自由流電泳是指在芯片中通過外加電場使樣品隨緩沖液連續流動的 同時沿電場方向進行電遷移，從而按照電泳淌度不同實現分離的電泳分離模式。,Raymond 等采用芯片自由流電泳模式分離了人血清蛋白、緩激肽和核糖核酸酶A，其分離長度為3.1cm，流出時間為62s。Kobayashi等采用自由流電泳的分離模式 在一個體積為56.5mmx35mmx30微米的微分離室（60微升）中實現了持續的蛋白質分離，并用羥丙基甲基纖維素涂覆來抑制蛋白質吸附，在25min 內有效分離了細胞色素C 和肌紅蛋白。最近，Kohl-heyer等制作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質的玻璃芯片，成功地將人血清白蛋白（pI=4.4）與等電聚焦標記物（pH3和9）分離。

微流控芯片毛細管電泳系統應用于蛋白質的分離分析具有突出的優越性，特別是在臨床檢驗及現場監測等方面的應用具有良好的發展前景，同時，其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發展也具有重要意義。據文獻報道，Renzi等已經研制出手持式的微流控芯片電泳分離蛋白質裝置。該裝置由電泳芯片、小型激光誘導熒光檢測系統以及高壓電源等組成，其體積僅為11.5cmx11.5cmx19.0cm，可用于現場分析、床旁醫學診斷以及取證 分析。近年來，國內已有關于利用芯片毛細管電泳進行臨床尿蛋白和脂蛋白檢測的報道。最 近，Pandey等使用 Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白質芯片來檢測微量的白蛋白尿，將蛋白質的電泳分離和熒光檢測集成化、自動化，實現了其在臨床實驗室的應用。

目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛細管電泳與質譜聯用技術的研究，以進一步提高系統對復雜樣品的分離分析能力。上述系統在蛋白質分離分析及蛋白質組研究中有廣闊的應用前景。尤其是對于復雜蛋白質樣品的多維分離分析，芯片毛細管電泳以其快速高效的特點，可以作為其中的一維分離方法，顯著提高蛋白質的分析通量。相信隨 著研究的不斷深入及相關技術的不斷發展，微流控芯片毛細管電泳蛋白質分離技術將日趨成熟，在生化分析、臨床診斷和蛋白質組研究領域發揮重要的作用。（文章節選來源：浙江大學微分析系統研究所 文章編號：1000-8713（2008）03-0269-05 轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）