1.什么是微流控層流技術？

基于微型通道自身的層流特點而發展起來的多相層流技術 , 從最初的液-液微萃取開始 ,由于其結構加工簡單、操作方便和分析功能強大 ,已逐漸發展成為一種加工分析方法 ,為微流控分析的研究應用打開了一個嶄新的局面。

自從微全分析系統的概念提出以來 , 由于微流控芯片分析本身具有試樣消耗少、分析時間短、效率高、尺寸小、集成度高和便攜等優點 ,在短短的 10 余年中就已經發展成為當前世界上最前沿的科技領域之一。

其中微流控芯片是1990年代初中期在分析化學領域發展起來的一門新型的分析科學。該門學科以分析化學為理論基礎 , 結合微機電 (micro electrical mechanical systems , MEMS) 加工技術方法 , 主要以微管道網絡為結構特征 , 被廣泛應用于分離 分析、生物科學和生命醫學研究等眾多領域 , 是當前微全分析系統領域發展的重點。基于微通道的特點而發展起來的多相層流技術分析方法 , 由于其結構加工簡單、操作方便易行、分析功能強大和應 用前景廣泛等優勢而得到人們的普遍關注。目前 , 已經有大量文獻報道采用層流技術實現了微流控芯片通道的加工制作 , 如液-液萃取、過濾和無膜擴散、聚合物薄膜的制備、納米材料的制備、細胞的研究和有機反應的控制檢測等。不可否認 , 多相層流分離微流控系統為微全分析系統的研究應用打開了一個嶄新的局面 , 在微芯片上實現樣品采集和預處理、試劑分離提純、在線檢測和數據采集一體化起到了重要作用。隨著其自身理論的不斷完善和發展微流控層流技術必將在未來的應用領域發揮更大的作用。

2.微流控層流技術原理

雷諾實驗表明 , 流體的流動狀況不僅與流體的流速 u 有關 , 而且與流體的密度ρ、粘度 μ和流體通道的幾何尺寸(如圓形管道的管徑 d) 有關。由此得到 Re = duρΠμ, 其中 Re 即為雷諾數 ,用以判斷流體的流動型態 :該式表明雷諾數與管徑、流體流速、 流體密度成正比 , 與流體的粘度成反比 , 其實質反映了流體流動中慣性力與粘滯力的對比關系。流體的流動型態根據雷諾數 Re 的大小可以分為層流和 湍流兩種型態。當流體流速較小時 , 流體質點只能 沿流動方向做一維運動 , 與其周圍的流體間無宏觀 的混合 , 即分層流動 , 而且流體的流速穩定 ,這種 流動型態即為層流 ;當流體流速增大到某個值后 , 流體質點除流動方向上的運動之外 , 還向其它方向 做隨機運動 , 即存在流體質點的不規則脈動 , 彼此混合即為湍流。當慣性力占主導地位時 , Re 較大 , 湍流程度較大 ;當粘滯力占主導地位時 , 則 Re 較小 , 將抑制流體的湍動 , 以層流為主。一般劃分 標準為 : 當 Re < 2000時 , 流體流型為層流 ; 當 2000 < Re < 4000時 , 流體流型受外界條件的影響 , 有時為層流 , 有時為湍流 ; 當 Re > 4000時 , 流體流型為湍流。

典型的微流控通道結構需要樣品和試劑量在 100 nl 和 10μl 之間 , 甚至更少 ,微流控通道的直徑 范圍在幾十到幾百微米。根據 Re = duρΠμ可知 , 在 微流控通道中流體的流速越低 , 試劑的粘度越大 , 則流體的 Re 越小。基于微芯片上通道的尺寸特點 可以了解到流體在通道內均呈現層流特性。因此 , 當兩種或更多不同試劑流同時流入同一通道 中 , 各試劑流能夠同時保持自身的流型不變而只在相與相的接觸界面上發生反應或分子擴散現象 ,并且具有較高的穩定性和重現性。大量的文獻報道了 根據微型通道內的層流特點的應用研究工作。根據這一基本原理 , 多相層流微流控系統被廣泛應用于眾多領域。

3.微流控層流研究與應用

①層流界面之間的分子擴散、轉移現象及應用

萃取是化學實驗中一項最基本的操作之一 , 主要是體現在兩個不同液相界面上的分子的擴散、轉移。由于微芯片上的微型化通道具有較大的比表面積和較小的擴散距離等優點 , 微通道內的萃取操作 具有試劑消耗量極少、擴散時間短和分析速度快等 優勢 ,從而實現在不用任何機械攪拌、混合、震蕩的條件下完成高速高效的分離分析。還可以針對不同 的需求設計出不同的微通道模型 ,如單一的“H”型、 “Y”型、“T”型 ,以及復雜的網絡型、二維通道、三維 通道等。在生命科學研究 ,尤其是在貴重試劑的制備和分析檢測等方面具有廣泛的應用前景。

目前 ,在這方面的研究已經取得了很大成功。 Yager 等根據兩相界面間的分子、離子的擴散來研究 H + 的過濾[15 ]在微流控芯片上完成了 Ni2 + 從水溶液中向氯仿中的萃取 ;在多相層流微流控芯片上實 現無機相和有機相界面間 Co2 + 的分離分析等。 Tokeshi 等也利用微型注射泵有效地控制有機相和水相的流速從而保證在微通道中形成穩定的層流 , 將 Fe2 + 從水相中萃取到有機相中。在溶液中加入染色示蹤試劑 ,根據染色劑流向可以觀察到 Fe2 + 從水相萃取到有機相的全過程 ;通過變換實驗條件 , 分別檢測不同濃度的標準 Fe2 + 溶液 ,根據得到的數據作出標準曲線圖 ,就可以進行定量的在線檢測。 Zhao 等 利用層流技術結合逆流進樣的方法實現了兩種不溶相之間的萃取操作 ,該方法使兩相界面之間接觸更加充分 ,萃取更加完全。方群等在液-液萃取 ,微孔膜萃取和液-液萃取與氣相色譜聯用等方面的研究也都取得顯著的成績 ,實現了層流 分離對溶液中 K + 的提取和在線電化學檢測。

隨著這一基本操作的日趨成熟和完善 , 這種技術方法已經被進一步應用到有機合成反應的研究 , 尤其是貴重、難以制備的試劑間的反應 , 以及反應速率的控制與檢測等眾多領域。應用層流連續平行流的特點 , 通過有效地控制微型通道的長度來控制反應時間 , 使反應能夠穩定進行并且盡量提高反應產率。層流分析技術將芯片分析與質譜分析或氣相 色譜分析聯用 ,大大節約了分析成本 ,已經初步實現了產業化。在生物醫學方面也利用層流技術對脂肪層生物蛋白質進行了立體性選擇分離和提純等分析操作, 采用計算機模擬的方法根據復雜的微通道網絡中的溶液與示蹤染料的混合流向 , 計算分析得到了微芯片通道選擇分析的最佳流體流向途徑和最優化數據。

隨著層流在萃取等方面的研究應用 , 其檢測技術也有了進一步的發展提高。目前 , 在層流萃取分析方面應用了在線照相(photograph) 檢測技術 , 能夠準確直觀地觀測分析的整個過程。某文獻報道了應用準彈性激光散射檢測方法 ( quasi2elastic laser scattering ,QELS) 分析層流過程中水相Π有機相界面間金屬鰲合物的萃取現象。在這種方法中不必用探測示蹤原子或分子 , 檢測簡單準確, 可以適用于溶液的溶解、混合、萃取等研究領域。

②層流界面間的化學反應及其應用

由于層流一維流體的特點 , 在接觸界面間可以保持自身穩定的流型不受破壞 , 如若控制流體的流 速則可以有效控制相界面間粒子擴散的程度。基于層流的這種特性可以在通道內實現試劑混合、聚合反應、催化反應、氧化還原反應、合成反應以及與之相關的反應速率控制 , 反應過程的在線觀測和反應產物的進一步檢測和應用等。

微通道內的雙相或者多相層流體系可以實現試劑特別是貴重的或者難以制備的試樣的混合 , 得到的混合溶液濃度和 pH 值等性質都具有很高的重現性和穩定性。這種方法尤其適用于生物科學和臨床醫學方面的研究 , 實現采樣、試樣預處理、化學反應 和分析檢測一體化。微芯片分析本身對試劑消耗量 僅為納升級 , 因此可以有效地節省在轉移、分析和存貯過程中的試劑損耗。例 如 , Hosokawa 等設計出一種微型的試劑混合器 , 這種裝置將 4 個疏水性微型毛細管和1個微通道連接在一起 , 通過調節毛細管中氣體的壓力 , 使得微通道中兩相流體在氣壓的作用下混合完全 , 該體系尤其適用于微量和痕量分析。Manz 小組也根據微通道內平行層流的特點設計了一個微型試樣混合器 , 這個芯片由玻璃Π硅片Π玻璃三層結構組成 , 其尺寸大小為 5 ×10 ×2 mm ,該微通道的內存容量僅為 600 nl。為了檢驗該微通道的試劑混合性能 ,將熒光素和羅丹 明作為兩相待混合流體通過進樣口的多組毛細管流入同一微通道內 , 可以觀察到多組層流在通道內逐 漸混合為一體的過程 , 同時可以檢測到整個試劑混合過程花費的時間僅僅為毫秒級。經過實驗測定 ,這個微型混合器適用的流體流量范圍非常廣泛 , 1 —200 μlΠmin 的流體流量溶液都可以達到很好的混合。

在整個合成反應中 , 試樣的混合、加熱和冷卻是一個關鍵的整體步驟。由于容器自身的特點 , 在容器中的反應經常是首先在局部發生 , 從而產生一些不必要的誤差并且反應效率也會受到影響。微通道具有較高的比表面積 , 而且對溫度的控制很容易實現 , 通過電熱塊加熱控溫可以形成較好的溫度梯 度 , 有利于反應速率的控制。應用網絡型微通道設計可以實現試樣在線混合、檢測以及反應的 控制等操作。多種試劑從不同進樣口進入同一微通道內 , 在網絡型微通道內實現試樣的充分混合 , 使反應進行完全。

應用層流間兩相的聚合反應在微通道內形成聚合物薄膜 , 將微通道分為兩個獨立通道 , 通過這層 聚合物薄膜可以實現不同流相中粒子的選擇分離提 取 , 這也是層流分析的重要應用之一。Hisamoto 等 就曾經提出由于微通道具有較大的比表面積 , 可以通過有機相Π水相兩層流 , 有機相Π水相Π有機相 三層流界面間的聚合反應 , 在通道內部形成平行的尼龍聚合物薄膜結構(如圖 1 所示) , 并且應用這種通道內薄膜實現了 NH+ 4 的滲透分離和聚合物薄膜的表面酶化。Peterson 等也報道了相似的在微通道內形成聚合物薄膜的加工方法。Kitamori等利用層流技術實現了在直徑250μm的微通道內水相 和有機相之間的化學合成反應。3 , 52二硝基氯苯作為有機相 ,和水相中的 DL212苯乙胺發生化學反應 , 該實驗表明層流界面之間的比表面積很大 , 使反應物之間可以充分接觸 , 因此與傳統實驗裝置相比較在微通道內進行的一些反應的產率較高。

圖 1 在 X型微通道內有機相Π水相界面間發生化學反應形成聚合物薄膜

另外 , 由于聚合物薄膜本身具有彈性 , 可以通過這種薄膜的平行穩定特性來控制通入通道內的液 體或氣體的流速或流量 , 以保證液Π液 , 液Π氣相對 穩定的流速和流量比率 ;還可用生化酶實現尼龍薄 膜的表面改性 , 使聚合物薄膜具有選擇性滲透、吸附的作用。根據這種層流反應可以在通道內形成多層平行的聚合物薄膜 , 用不同種類的生化酶分別對通道內形成的這種平行多層薄膜進行表面改性修飾 , 就可以實現多相平行分析檢測。根據同樣的原理 , 將催化劑有效沉積在薄膜的表面 , 可增大催化材料的比表面積 , 從而加快通道內相匹配的催化反應的速率。

利用層流界面之間的氧化還原反應 , 將金屬絲沉積在微芯片通道內 , 可以用作電極 , 將電化學檢測系統建立在微芯片上 , 實現微芯片上電化學檢測 與分離分析的集成化 , 應用在微反應器、微型傳感器中。Kenis 等利用微通道界面間的還原反應將 金屬 Ag 還原沉積到通道表面 , 形成一條精細的金 屬線。用作 Ag 電極 , 有利于芯片的集成化。利用相同的原理可將其它金屬與芯片結合 , 加工制作成微反應器或微型傳感器的敏感元件。這種加工方法對試劑的消耗量極少 , 因此更有利于一些貴重的稀有金屬如鈀、鉑等在微流控體系中的制備與加工。

③層流在制備納米材料方面的應用

隨著納米材料科學的快速發展 ,許多制作納米材料的方法已經被開發出來, 如固定的沸石微反應器和多孔硅質微反應體系等。但是這些加工方法本身的生產成本較高 , 難以得到普及應用。目前 , 某文獻報道了根據微通道內多相層流現象 , 即在不同相界面間發生反應和分子擴散這一特點 , 實現了通過控制反應流體的流速和粘滯力的大小控制反應產物顆粒的大小。Kenis 等提出使 NaHCO3 、CaCl2 和 KH2PO4三種溶液平行通入微通道內發生反應生成 CaCO3 顆粒沉淀 , 如圖 2 所示。這個實驗說明了層流反應形成微小顆粒的可行性。同 時 , 通過有效合理地控制流體的流速以控制在相界面上發生連續反應的速度 , 可以間接調節控制生成的沉淀顆粒大小 , 為納米材料的制備開拓了一個新的局面。Wang 等 利用層流反應生成的二氧化鈦沉淀顆粒就達到納米級 ,甚至小于 10nm。應用這種方法反應生成催化劑微型顆粒并且將其有效地沉積在通道內表面 , 可以用來實現通道內的催化反應。 如圖 3 所示 , 利用層流反應和溶膠2凝膠過程在微通道內壁固定一層納米級生化酶 , 從而形成一個生化酶固化微通道反應器 , 具有廣泛的應用 。除此之外 , 一些貴重金屬催化劑和有機催化劑也可以通 過這種方法制備到微型反應器中 , 從而加速并控制通道內反應的反應速率。這種方法同樣也適用于生 物大分子和蛋白質分子形態的控制 , 例如應用層流定位觀察控制神經細胞的生長過程。

圖 2 在微通道內由 NaHCO3 , CaCl2 和 KH2 PO4 三相流體形成的兩層界面之間發生沉淀反應形成方解石和磷灰石顆粒的過程

④微流控層流刻蝕加工技術

多相層流微流控體系也發展并完善了微芯片的加工技術。普遍被應用的微芯片的加工技術是光蝕刻和軟蝕刻兩種 , 但是這兩種方法的精密度較低、 制作工序復雜 , 而層流蝕刻的發展則有效補充了前兩種制作方法的這些不足。如微型 印刷術 (microprint) 、在毛細管內的微型模板技術和可復制模板技術等 ,比傳統的加工方法更加簡便易行 , 不 必經過復雜的封合步驟 , 并且有利于實現復雜的多維通道模型的加工制作 , 從而有效地提高了芯片的集成度。最值得一提的是它可以在密封的毛細管通道內進一步刻蝕加工 ,提高了微芯片通道的復雜化 程度。它不僅可以應用于玻璃芯片 (通過 KF 溶液 和 HCl 溶液的層流反應蝕刻得到) , 而且可以應用于聚二甲基硅烷 (polydimethylsiloxane , PDMS) 材料上 , 而這種材料更適合于生物醫學和藥物分析方面的研究。Chen 等  應用層流技術在線得到不同濃度的光刻膠溶液 ,同時將光刻膠涂覆在 PDMS 澆注得到的三維微通道內作為光刻掩膜 ,然后用紫外光照射。由于通道表面涂覆的光刻膠具有一定濃度梯度 ,顯影后得到的微通道也具有一定的大小梯度 ,繼而得到不同深寬比的微通道 ,可將其應用于生物細胞分析領域。

在應用微流控毛細管電泳技術分析研究細胞過程中 , 細胞的進樣、沉積以及溶膜過程是研究的熱門課題。由于細胞本身多帶有電荷 ,因此一般采用夾流進樣的方法 , 通過控制電流的方向和大小 ,從而使得細胞貼壁沉積 , 然后溶膜。這種技術方法要 實驗技術較高并且電滲流會影響分析的過程和結果。而應用層流刻蝕的方法加工制作微芯片 , 使得通道內部可以提供與細胞尺寸相當的定位點 , 從而有效控制細胞 ,實現對細胞的進一步分析檢測。 如圖4所示 ,采用層流刻蝕技術 ,通過控制流體的流量大小 ,按照微通道加工需要 ,調節蝕刻劑和非蝕刻 劑流量比率 ,就可以在通道內蝕刻出細胞大小的凹槽等需要的通道形式 , 以便于細胞的沉積和分析等。

目前 , 層流刻蝕形成的芯片已經被廣泛應用于生物醫學分析和藥物合成領域 , 加快了化學生物分析技術的發展。層流刻蝕通過控制流速和流體粘度 來控制通道的內徑與細胞生物大分子的大小相適應 , 從而實現對其的分離分析和定位分析等。

⑤微流控層流在生命醫學方面的應用

微通道內的多相層流擴散分離技術也逐漸在生命醫學方面的研究中得到廣泛應用。兩相或多相流體形成的界面可以根據粒子如離子、蛋白質和細胞等的大小進行選擇擴散。小粒子可以通過界面擴散到相鄰相中而留下大粒子 ,從而達到不同 粒子的分離分析 , 可應用于人血液中血清白蛋白的測定 ,血液 pH 的測定 ,血液中 K + 的測定 ,細胞內物質的提取、分離與檢測 , 以及蛋白質的凈化等。

圖4層流刻蝕加工的結構舉例 :a、b) 通過從進樣通道調 節流體的流速形成不同尺寸的微通道 ;c) 在微通道內定位 蝕刻 ;d) 7 個進樣流體層流蝕刻而獲得的復雜結構 ;e) 同時控制刻蝕液的流速和通過時間而獲得的多層次結構

根據細胞或蛋白質的大小不同 ,層流技術可以實現生物試樣預處理和分離提純等。例如傳統捕獲 精子的方法是難以操作和控制的 , 而應用多相層流技術將試劑中的活精子和死精子以及其他大分子殘 骸分離的方法 ,既簡單又容易操作控制 , 實現了試樣的預處理提純 , 提高了在線檢測的分析效率。這種技術設計填補了臨床上針對極少量精液試劑的分析設置。而且由于其小巧簡單 ,因此也同樣適用于家庭化檢測。Jandik 等根據生物分子的重量不同 ,在“H”型微通道內實現了抗生素的預處理工作 , 完全避免了使用離心分離機或者其它通用方法的不利影響。

一般生物分析中所選用的試樣量都是極其微量的 , 采用傳統的分析測定方法有較大的難度和不便 , 而采用微流控系統控制解決小體積貴重試劑的混合和稀釋 ,比傳統的溶液混合稀釋方法要操作簡單易行而且分析效率也較高。Jiang 等提出了一個微型稀釋網絡通道設計 (microchannels microdilutor networks , μDN) , 在微通道內實現對生物抗體和抗原試樣的預處理 , 應用微流控通道網絡實現溶液的連續性稀釋 ,從而得到一系列不同濃度的溶液 , 并 在同一芯片上實現艾滋病毒 (HIV) 的在線分析檢測操作。最近 ,Whitesides 等 利用同樣的層流分析原理 ,采用螺絲作為閥門 ,控制流體流向 ,實現了芯片微通道內生物免疫分析 , 成功地實現了對人體內血清 IgA 和 IgG值的分析測定。相信這種方法將在臨床醫學、環境科學和生物化學領域有著廣泛應用前 景。另外 , 也有文獻提出網絡型微芯片通道的分析過程 , 即通過研究控制流體的流速 , 在通道內以層流的方法將溶液混合稀釋而形成固定的濃度梯度特征。因此可以形成一系列具有固定濃度梯度的溶 液 ,以用于分析檢測和標準曲線的繪制。

另外 ,根據微通道內流體的層流特性可以實現 對一些生物反應的在線檢測。一些生物反應如細胞體的特性檢測都是在極短的時間內進行完全 ,而且 細胞分子體積小 ,難以控制 ,若選用常規方法觀察分 析是難以完成的。微通道內層流具有較高的流體穩 定性和重現性 ,因此更加便于芯片內細胞反應的觀察研究 ,實現“定位分析”。Takayama 等 在 PDMS和玻璃的混合芯片的微米級通道內 ,通過控制進樣壓力實現了在 3 個微通道匯合處對單一細胞的分析檢測 ,并且在微通道內實現了細胞沉積和酶催化。該實驗論證了不同蛋白質和細胞的表面型 態 ,并且解釋了酶對細胞或細胞內蛋白質的選擇反 應。Yamada 等在 37 —96μm 的微通道內利用兩相層流技術實現了大細胞的萃取分離分析。實驗表 明 ,當微通道的內徑進一步減小 ,分離效率也會有很大的提高。

3.微流控層流發展的方向

目前微流控多相層流技術已經取得了有目共睹的成就。我們相信微流控多相層流技術將會發展得更加成熟 ,其發展前景具體體現在以下幾個方面 :

(1)在微流控芯片加工技術方面來看 ,充分應用計算模擬技術設計微芯片模型 ,使得層流不再只是適合于簡單 的“T”型、“Y”型通道。考慮到微芯片通道與傳統分析反應器的區別 ,加強對通道的模型、尺寸以及深寬比的理論研究和對芯片通道內壁的涂覆和化學修飾的研究應用 ,從而有效提高微芯片通道內的反應穩 定性 ,提高分析分離的靈敏度 ,延長芯片的使用壽命。另外 ,在加工材料的選擇方面 ,不僅僅是應用光學玻璃 ,更應擴展對其它材料的嘗試和使用。目前有機聚 合物材料如PDMS、聚甲基丙烯酸甲酯 (polymethyl methacrylate , PMMA) 和有機玻璃等的廣泛使用 ,彌補了玻璃作為通道載體的加工過程繁瑣 復雜、通道深寬比難以控制等不足。（汶顥股份提供PDMS芯片、PMMA芯片、玻璃芯片、紙芯片等材質微流控芯片）

(2)在應用的范圍上來看 ,目前層流技術還只是應用在兩相或者三相的分析反應上 ,層流技術在多相平行分析方面的應用還有待于進一步提高。這就對微芯片通道的加工設計提出了新的要求。層流技 術的應用將不會只是局限于二維通道 ,而是會被廣泛應用于PDMS等材料制備的三維芯片上。相信立體化、多樣化的微芯片通道將會更加成熟地發展下去 ,也將為擴展多相層流的應用提供必要的條件。

(3) 微芯片的集成化更是目前和將來研究的重點。芯片通道的微型化有著優于傳統分析儀器的一 些特點 ,但是由于微芯片耗試劑量極小 ,因此仍然存在著采集、進樣和檢測等系統和芯片難以匹配的現象。這也是要盡快解決的問題 ,否則微芯片的應用發展同樣會受到這些因素的影響限制。Du 等 成功地將流動注射自動進樣系統與微芯片通道聯系起來 ,實現了進樣與分析的一體化。該體系能夠實現 10000 Πh 進樣分析 ,為微芯片的廣泛應用打開了一個新的局面。在微芯片上實現采集、進樣、分析和檢測的集成化是微芯片研究的一個關鍵所在 ,也是微芯片走向工業化應用的基礎。

(4) 當前微流控分析的重要研究方向包括細胞生物學應用 ,免疫及分子診斷、臨床分析應用和納流控分析等 , 強調對單細胞分析的采樣、定位、溶膜等過程的操控。層流作為其中的一種加工和分析手段 將具有廣泛的應用前景 ,它將被普遍應用于分離分析、合成反應、材料制備、模型加工、臨床醫學和生物化學等眾多領域。（原標題：微流控層流技術的研究 文章來源：浙江大學化學系 微分析系統研究所 文章編號 : 10052281X(2006) 07/8-0966-08）