自1985年Kary Mullis發(fā)明PCR技術(shù)以來，PCR及時一直生物醫(yī)學領(lǐng)域中重要的實驗方法。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR是目前的主要核酸定量方法。數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，由于其不需要建立標準曲線，可以對核酸的拷貝數(shù)進行絕對定量，因此具有更廣泛的應(yīng)用前景。

數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)的原理并不復(fù)雜，dPCR是一種對含有核酸分子的標準反應(yīng)體系進行有限稀釋，使稀釋后的每個反應(yīng)含或不含一個或者多個拷貝的待檢靶分子（DNA模板），實現(xiàn)每個反應(yīng)為一個獨立的PCR反應(yīng)器，經(jīng)PCR擴增后對每個獨立反應(yīng)進行檢測，并以終點信號的有或無作為判斷標準（有熒光信號的微滴判讀為“1”，無熒光信號的微滴判讀為“0”）。最后，根據(jù)泊松分布原理及陽性反應(yīng)器的比例，利用分析軟件計算待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，從而獲得最終結(jié)果。

dPCR的特點是靈敏高、定量精確、檢測的線性范圍寬、特異性好、費用適中，是一種很有前途的分子定量檢測手段。dPCR與傳統(tǒng)PCR、定量PCR相比，定量結(jié)果不再依賴于Ct 值，直接給出靶序列的起始濃度，實現(xiàn)真正意義上的絕對定量，因此這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面的應(yīng)用優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。

dPCR基本原理（微滴式）

數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。

數(shù)字PCR的產(chǎn)生和發(fā)展

20 世紀末，Vogelstein 等在檢測糞便中進行癌變組織脫離細胞的BRAF特異突變型基因時，因受到體細胞基因的干擾，而碰到檢測靈敏度和檢測分辨率的瓶頸，而采用了在384孔板中對每個反應(yīng)孔的樣品量進行極限稀釋并增加反應(yīng)孔數(shù)進行檢測的方式，從而提出了數(shù)字式PCR的概念，同時也提出如果采用更多孔板其檢測靈敏度會更高，從而指出了數(shù)字PCR系統(tǒng)的發(fā)展方向。

雖然dPCR技術(shù)的原理并不復(fù)雜，然而早期在第一步的樣品稀釋的環(huán)節(jié)上卻遇到了相當大的困難，在稀釋的數(shù)量和均勻性上都很難達到要求，這一困難極大地限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。直到近幾年，dPCR技術(shù)終于突破了技術(shù)瓶頸，實現(xiàn)了商業(yè)化產(chǎn)品，目前主流核酸樣品稀釋分散技術(shù)主要包括基于微孔板，油包水微滴，微流控芯片等。

基于微孔芯片的數(shù)字 PCR 檢測

數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

1. 稀有變異檢測

從外周血內(nèi)獲得分子生物標記物、進行特異突變篩查、監(jiān)測病程是醫(yī)療保健的一個發(fā)展方向。這要求檢測體系(探針和引物)必須保證能在高背景野生型等位基因存在的條件下檢測到低豐度的突變基因。由于數(shù)字PCR降低了對反應(yīng)擴增效率的要求，采取終點法判讀的方法，數(shù)字PCR可以很好的勝任稀有變異檢測的工作，同時也減少了引物設(shè)計過程中由于擴增效率不合要求而造成的浪費(時間、樣品、耗材等等)。 

2. 拷貝數(shù)變異

雖然生殖系或體細胞拷貝數(shù)變化是否具有臨床意義需要取決于具體臨床情況，但CNV改變基因表達水平卻有十分重要的臨床意義。數(shù)字PCR具有準確性和精確性的特點，這使得其可以在CNV研究中發(fā)揮重要的作用。在有已知拷貝數(shù)的內(nèi)參基因的前提下，數(shù)字PCR不但可以清晰區(qū)分一個或者兩個拷貝，更可以對多拷貝基因進行分析，例如，五個或者六個拷貝。在這一點上，相比于包括qPCR在內(nèi)的常規(guī)方法，數(shù)字PCR優(yōu)勢明顯。 

3. 樣本需求量低

數(shù)字PCR的一個主要優(yōu)勢是所需樣本量很低，這對于一些臨床樣本來說特別重要，尤其是樣本珍貴或者樣本核酸存在降解的情況下。目前很多基因組研究方法，例如CGH芯片、二代測序等，在實驗之前都需要對有限的臨床樣本進行擴增以保證達到實驗樣本量的要求。然而，實際情況是，預(yù)擴增會引入偏向，無法保證不改變樣本內(nèi)待測基因的相對豐度，對實驗結(jié)果影響的嚴重程度取決于不同的應(yīng)用。 數(shù)字PCR樣本需求量低的特性可以避免由于預(yù)擴增所引入的實驗誤差，更好的實現(xiàn)實驗的精準性和可靠性。 

4. 分析便捷

數(shù)字PCR有或無的結(jié)果判讀非常簡潔。對于相對定量分析來說，只需使用泊松原理將陰性/陽性微滴的比例轉(zhuǎn)換成表達豐度、使用一個或多個內(nèi)參基因進行均一化后即可完成分析。  

5. 與二代測序整合

如何在臨床領(lǐng)域發(fā)揮NGS的巨大優(yōu)勢是一個重要的問題。數(shù)字PCR是一項非常有用的互補型技術(shù)。例如：使用數(shù)字PCR檢測患者特異性標記物，與腫瘤配對末端測序?qū)嶒灲Y(jié)果進行相互驗證，并且可以進行NGS文庫的制備和定量。 

數(shù)字PCR為分子生物學、微生物學、液體活檢等領(lǐng)域提供了新的檢測方法和實驗思路。從應(yīng)用范圍和實驗成本角度來看，數(shù)字PCR不可能完全取代熒光定量PCR，但從重復(fù)性、準確性和樣本量方面可以給PCR技術(shù)帶來重要的補充。

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