現場快速檢驗（Point-of-Care Test, POCT），也稱即時檢驗，國際上通稱的POCT，是體外診斷行業增長最快的領域。被廣泛使用的血糖儀即為最成功的POCT產品，占有整個POCT市場60%以上的份額。目前市場上最有代表性的兩種便攜式POCT技術是膠體金（或熒光）免疫層析技術和熒光免疫毛細技術。前一種以多家中國公司的產品為代表，后一種以美國Alere公司的Triage產品系列為代表。免疫層析技術起始于上世紀80年代初，而Triage產品的開發始于上世紀90年代，都已有了二三十年的歷史。近兩年來，中國、美國等世界上主要國家都在大力推行精準醫療、并已把精準醫療定位為長期戰略發展方向。精準醫療首先需要精準診斷，這就對醫療檢測儀器的性能提出了全新的要求。在此大背景下，兩項關鍵技術在醫療檢測行業迅速發展，一個是生物芯片技術，另一個是微流控技術。理邦m16磁敏免疫分析系統（生產單位：深圳市理邦精密儀器股份有限公司，簡稱理邦）是其中一個具有代表性的產品。它把微陣列生物芯片集成進了微流體器件里面。其生物芯片是一個多層納米膜結構的微陣列、是通過大規模集成電路工藝制造的。相對于傳統意義上以玻璃片為基底、以熒光材料為標記物的基因芯片，m16上的生物芯片是在單晶硅片上實現的、通過量子力學現象傳感的技術。其微流控技術依賴于機械機構對被測樣本和測試試劑實現精確控制。

1.免疫層析技術

技術原理

圖1所示的是膠體金免疫層析測試卡的結構，由樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊構成。其中，膠體金顆粒上修飾有檢測抗體，硝酸纖維素膜上有檢測線和控制線。檢測時，被測樣本在毛細作用下通過膠體金標記的抗體，形成抗原抗體膠體金復合物，復合物繼續爬行，通過包被有捕捉抗體的檢測線，形成雙抗體夾心膠體金復合物，在檢測線處呈現色帶。過量的膠體金抗體流過檢測線，在之后的控制線上形成膠體金免疫復合物，呈現色帶。需要注意的是，控制線上色帶的形成與被檢測物質的存在與否無關，即使樣本里沒有被檢測的物質，控制線也會顯現。這種“捕捉抗體-抗原-檢測抗體-膠體金納米顆粒標記物”復合結構被稱為雙抗體夾心結構，膠體金為指示標記。最典型的產品是“早早孕”試紙條，采用雙抗體夾心一步法技術，以膠體金為指示標記檢測尿液中的人絨毛膜促性腺激素（Human Choionic Gonadotophin，HCG）濃度，以判斷受檢者是否受孕。

圖1 免疫層析技術原理

質量控制

圖2所示是免疫層析產品的生產過程。首先在大張層析膜上噴畫控制線和檢測線，然后把此大張層析膜粘貼在支撐底襯上。這個過程必須要確保底襯和膜的接觸緊密、均勻一直，否則將會導致不同測試條（卡）之間的液體流動速度和方式有很大的不同。下一步是粘貼膠體金墊、樣品墊和吸水墊。吸水墊和膠體金墊各自和硝酸纖維膜有部分交疊，樣品墊覆蓋了膠體金墊的一部分。這里面最需要注意的是各層之間的交疊、接觸需要密切、均勻，不能在任何膜層表面引入物理變形、污染物、或者化學雜質。很多和液體流動均勻性有關的問題都和以上這幾個過程有關。最后一步是在溫度和濕度都受控的房間里，把上面制作的大張材料切割成一條條的試紙條，組裝入塑料殼。

圖2 免疫層析產品的制造過程

從上面的制造過程可以看出，同一大張材料上切割出來的測試卡的一致性會比較好，因為是在同一個時間、同一個環境條件、用同一片材料、同一次制作過程完成的。比較難以控制的是不同批次間的差別。所以質量控制也應該主要關注批間差。

建議質量控制流程如下：

保留最少18個質量有保證的測試卡。

準備最少兩個濃度的樣本，一個是在cut-off值附近，另一個是中值。

如果有檢測全血、血清、血漿等不同樣本的需求，則需要按照2來準備不同的樣本。

每個濃度點測試3個卡，計算平均值。

如果平均值相差超過10%，則新批次測試卡不合格。

如果使用溫度和室溫（25℃）相差較大，則需要和室溫結果比對。

以上第二項考慮的是，如果測試卡存在問題，那問題在cut-off值附近會被放大。第三項的考慮是不同的樣本黏稠度不同，對膠體金墊上顆粒的稀釋能力會不同，在硝酸纖維膜里的流動速度會有差別。而從前面的討論我們知道，樣本在膜中的流動速度是對測試結果影響最大的因素之一。第四點、第五點考慮的原因是，免疫檢測不可能100%完全重復，需要平均并給與一定的誤差量。

值得一提的是，膠體金免疫層析、熒光免疫層析、上轉發光免疫層析這三種產品都是建立在“層析”這個技術平臺上，所以以上的討論對三種技術均適用。但是，熒光的使用使檢測靈敏度得到了一定程度的提升。熒光免疫層析的一個很大的問題是散射的入射光對檢測信號的干擾，而使用上轉發光可以有效地消除這個問題。

2.微流體技術

從上面的討論我們可以知道，層析檢測技術是一項看起來很簡單、但是實際上很復雜的技術。里面最少有4種薄膜、兩種抗體、抗體修飾的膠體金顆粒、緩沖液、封閉液等。制造過程最難把控的因素來源于：①把各種生化試劑載入相應的材料中并進行干燥；②把各種材料完美、重復的組裝在一起。任何存在于各層材料之間的界面缺陷和界面不重復性都會直接導致檢測結果的重復性變差甚至失敗。解決這些問題的一種辦法就是擯棄層析這個平臺。美國Alere公司旗下的Triage產品系列就是采取了這樣一種方略。

圖3 Biosite微流體測試卡結構

圖3所示是美國Alere公司旗下的Triage產品系列的測試卡結構，其中沒有任何的薄膜材料。它有上下兩層材料組成，兩層材料之間的距離是可以產生毛細現象的距離。上層為高度透明材料，目的是可以使在兩層材料之間產生的熒光信號不受干擾地傳播到透明材料另一側的熒光檢測器件上。底層表面的地貌隨需求變化而不同，而最突出的特征就是“搓衣板”地貌。這樣一個“搓衣板”地貌可以有效的增加表面積、增加抗體固定量及固定強度。在測試區域的表面上修飾的主要是捕捉抗體和封閉試劑，在樣本準備區域的不同部位上修飾有熒光標記物、檢測抗體、緩沖試劑、封閉試劑等。樣本進入測試卡以后，其中液體溶解各種生化試劑，毛細作用推動試劑向檢測區流動。

毛細現象是一種自然界發生的被動現象，會隨著環境條件及液體特性而發生變化。要想解決這個問題，就必須對微流體進行控制。理邦的m16磁敏免疫檢測平臺采用的就是這個理念。圖3所示是理邦m16產品系列微流控測試卡流體線路圖。在這里稱之為微流“控”而非微流“體”是因為它對微流體的流動實現了控制的功能。在這個微流控結構里共有三個線性微流體泵，分別對三種試劑進行控制。根據理邦提供的數據，驅動裝置是由步進電機構成，每1 mm的驅動距離可以分為25000步，也就是說，每一步的驅動位移是40 nm。微流體泵體的直徑大約是3 mm。換算成體積，步進電機每走一步所移動的試劑體積是0.0028μL，實現了精確控制。因為是微流體泵控制的流動，也因此避免了因樣本組分或黏稠度不同而導致流速不同、測試結果不同的問題。另外，因為速度是可以調節的，所以可以針對不同的檢測項目（心肌標志物、炎癥、傳染?。┻M行優化，以達到最佳檢測結果。

圖3 理邦m16微流控測試卡結構

在前面所描述的層析和毛細微流體平臺中，樣本中的液體作為溶劑把各種生化材料溶解在一起流到反應區域。在檢測區和背景區域結合上的非特異信號物是靠最后殘留的多余樣本進行清洗，沒有專用清洗液體。在這兩個方面，m16平臺采取了完全不同的方案。為了避免各種試劑之間的相互干擾或交叉反應，m16微流控測試卡采用了3個微流體泵，對不同的試劑依次分別注入反應。在注入不同的試劑之前，微流體泵驅動的清洗液對反應空間進行徹底清洗，有效的消除非特異吸附。m16的另一個獨特之處是微流體泵不僅可以控制試劑和樣本的流動速度，而且可以控制其流動方向。反應試劑可以前后來回震蕩，增加反應結合律也即檢測靈敏度，清洗試劑可以通過來回震蕩來達到徹底清洗的目的。

3.生物芯片

生物芯片這個用語最早出現在基因檢測領域，由美國Affymetrix公司首先使用。圖4是該公司在2003年為羅氏生產的檢測CYP450基因的生物芯片，用于個性化用藥。它是以單晶硅為襯底，通過多層掩膜版的制造過程，在幾十萬個20 ?m2的檢測區上合成出不同的基因片段。因為使用了單晶硅硅片，采用了半導體行業常用的掩膜版光刻技術，最后產品外觀和半導體芯片非常類似，故被稱為生物“芯片”。類似技術已經在基因檢測領域大規模使用，但是在免疫檢測領域還沒有產品出現。

圖4 美國Affymetrix公司的CYP450基因生物芯片

理邦的m16磁敏免疫分析儀采用了通過多層納米膜淀積、多層掩膜板光刻等大規模集成電路工藝制造的生物芯片技術。圖5是其示意圖，其中每一個彩色正方形下面是一個由多條亞微米寬的巨磁阻器件構成的檢測區，每個檢測區上修飾有不同的捕捉分子，用來檢測不同的標志物。此示意圖中共有12個檢測區，可以檢測12種不同的生物分子。和Affymetrix芯片最大的不同是，m16生物芯片不僅僅是捕獲被測物質的載體，它還探測被測物質生成的信號。信號通過導線傳輸到儀器上，然后轉換成用戶可以使用的信息。Affymetrix的芯片只是捕獲被測基因的載體，其上產生的熒光信號要通過一個熒光掃描設備來讀取。

圖5 理邦的m16磁敏生物生物芯片示意圖

m16生物芯片的工作原理如圖6所示。首先通過大規模集成電路工藝在硅片上生產巨磁阻（GMR） 微陣列芯片。GMR芯片有極高的靈敏度、可以檢測到單個納米磁顆粒[6]。硅片切割成單個芯片以后，首先在上面修飾上捕捉抗體。當樣本被加到芯片上以后，其中的被測分子和捕捉分子發生反應、結合。然后加入修飾有檢測抗體的納米磁顆粒，檢測抗體和被測分子結合，形成圖6所示的復合結構。納米磁顆粒作為標記物被GMR器件檢測。在樣本中被測分子含量很低、也即需要高靈敏度的情況下，一個磁顆粒下面只會有一個被測分子。因為GMR器件可以檢測到單個納米磁顆粒，所以這樣一個結構就具有了檢測單個生物分子的超高靈敏度。

圖6 理邦m16磁敏生物芯片檢測原理

m16磁敏生物芯片是微陣列芯片，其上有多個檢測區域，可以同時檢測多種物質。比如，肝功4項、心肌標志物五項、呼吸道感染9項、腫瘤12項等，可以用單個微量樣本在同一個微流體測試卡上得到結果。更重要的是，部分檢測區可以被用來進行實時監測、校準，提高檢測結果的可靠性和一致性。在公式2的討論中我們提到，抗體抗原的最佳反應溫度是37℃，偏離此溫度會使反應速度降低、檢測結果變弱。在理邦m36的芯片上，有兩個溫度偏差校準區和一個反應過程校準區，可以實時校準此項因素。這項技術的另一個直接結果是，測試卡從低溫儲藏室取出后可以馬上進行測試、不需要恢復到室溫，這對急性心梗等需要快速結果的應用非常有利。試劑批次校準區可以校準運輸、儲存、試劑批間差等因素。另外根據需要，還可以在芯片上設計假陽性、假陰性校準，使檢測結果的準確性和可靠性有巨大改進。

圖7 理邦m36磁敏生物芯片應用方案一例

4.免疫層析技術面臨問題及解決方向

隨著醫療領域各項技術的發展，尤其是隨著精準醫療、個性化醫療的迅速發展，檢測技術也在兩個方面面臨著挑戰：第一是重復性，第二是靈敏度。對免疫層析技術來講，測試條之間的重復性問題是最大的挑戰，而重復性差的原因很大一部分是因為需要把多種纖薄、脆弱的材料粘貼在一起、同時保證其中液體流動的一致性。為解決這個問題，一些公司在開發新的材料和結構。Whatman公司的Fusion 5 單一薄膜代替了樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊[7]。Fusion 5 是一種大孔隙材料，液體在其中的流動速度很快，但是和蛋白質沒有親和性。同時，常規層析免疫產品使用的多次浸潤、干燥過程也不再適用，所以，需要一個完全不同的制造過程。目前市場上使用Fusion 5的產品并不多見。

解決以上所述重復性差的另一個思路是徹底擯棄層析膜以及其他薄膜，采用微流體結構。但是，微流體器件的研發需要機械、流體力學、化學、生物、精加工等尖端技術領域的密切合作，研發時間長，投入大。所以，除了美國Alere 公司的Biosite 產品系列，還沒有其他有影響力的產品出現在市場上。另外，從化學反應的角度出發，化學反應的結果受反應試劑量、反應溫度、反應時間等因素影響，免疫反應也不例外。所以，對微流體的精確控制是進一步改進重復性的關鍵。理邦m16產品實現了對流體的控制。“微”流體的“微”字意味著產品的原材料以及生產過程需要嚴密控制。理邦通過精密注塑來生產合乎要求的零部件。組裝線采用自動化機械手進行組裝，可以實現不大于幾十微米的組裝公差。

美國海軍實驗室的Baselt博士于1997年提出利用磁阻 （magnetoresistance, MR） 器件和磁標記物進行生物分子檢測的概念[8]。因為發現了更加靈敏的巨磁阻（giant magnetoresistance，GMR） 現象, 法國科學家Albert Fert和德國科學家Peter Grünberg獲得了2007年的諾貝爾物理學獎。目前用于磁敏生物傳感器的主要為GMR器件。認識到GMR微陣列芯片在靈敏度上的巨大潛力，除了美國海軍實驗室外，美國NVE公司，美國斯坦福大學、德國比勒非爾德大學、葡萄牙里斯本大學等29個公司、大學、研究院都在進行磁敏免疫檢測技術和產品的研究[9-12]。在國內，進行此研究的有中國科學院電工研究所、清華大學、上海交大、電子科技大學等，但是這些單位到目前為止還沒有能夠使GMR技術產品化，這里面最主要的挑戰是GMR器件和微流體器件的集成[13]。理邦m16磁敏免疫分析儀是近20年來首個出現在體外診斷領域的全新技術平臺，在靈敏度、重復性、多項目檢測能力等方面有明顯的技術優勢。

在將來的POCT市場上，免疫層析技術仍將會發揮很大的作用，然而不論是從基本的原理上亦或是從制造過程來看，免疫層析技術的內在缺陷也不可忽視，難以滿足精準醫療對檢測精度的需求。為了應對這些挑戰，一個研發方向是把幾種薄膜材料進行無縫集成、免去多個不同而且難以控制的組裝過程；另一個方向是對制造過程更精密的控制，把批次生產模式改成高度自動的流水線型生產模式。微流控技術可以精確控制生化反應過程（包括溫度、時間、速度、劑量），以達到精準檢測的目的。微陣列生物芯片技術可以使多項目聯檢成本顯著降低，同時陣列內的各種實時校準單元可以使測試準確性和重復性大大提高。 

參考文獻

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[9] www.nve.com.

[10] www.magarray.com.

[11] S. J. Osterfeld et al, Multiplex protein assays based on real-time magnetic nanotag sensing, PNAS, vol. 105, pp 20637-20640 (2008).

[12] F. A. Cardoso et al, Detection of 130 nm magnetic particles by a portable electronic platform using spin valve and magnetic tunnel junction sensors, Journal of Applied Physics, vol. 103, pp.07A310-1-07A310-3 (2008).

[13] L. Chen et al, A prototype of giant magnetoimpedance-based biosensing system for targeted detection of gastric cancer cells, Biosensor and Bioelectronics, vol. 26, pp.3246-3253 (2011).

（文章來源: (有改動)《中國醫療器械信息》 單萬水  科學網科學網轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）