新興單細(xì)胞診斷技術(shù)依賴于從復(fù)雜的生物基質(zhì)中快速有效地分離細(xì)菌的潛力。在表在《微系統(tǒng)與納米工程》上的一項(xiàng)研究中，美國(guó)機(jī)械工程、化學(xué)生物分子工程和生物工程跨學(xué)科部門的Jung Y. Han和同事開(kāi)發(fā)了一種利用微流體多孔二氧化硅單體從全血液中分離出完整活菌的裝置。實(shí)現(xiàn)了機(jī)械溶血，同時(shí)提供完整和活的細(xì)菌通過(guò)單體大小為基礎(chǔ)的細(xì)菌分離和選擇性裂解通道。

研究探索了整體形態(tài)、幾何形狀和流動(dòng)條件對(duì)細(xì)胞裂解的影響，以及允許多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌選擇性細(xì)胞裂解和選擇性通過(guò)的流動(dòng)狀態(tài)。采用的技術(shù)結(jié)合單細(xì)胞拉曼光譜可以快速制備樣品并進(jìn)行細(xì)菌分析。該研究提供了獨(dú)特的樣品制備步驟，以支持快速和無(wú)培養(yǎng)的細(xì)菌分析，在醫(yī)療點(diǎn)生物醫(yī)學(xué)設(shè)備的應(yīng)用。血液中的細(xì)菌可導(dǎo)致敗血癥、組織感染等嚴(yán)重狀況，需要及早發(fā)現(xiàn)血源性細(xì)菌才能有效治療。

利用定點(diǎn)診斷快速識(shí)別細(xì)菌的能力，可以極大地提高早期感染最佳治療的臨床潛力。現(xiàn)有黃金標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌特征是基于表型細(xì)胞培養(yǎng)分析和需要至少24小時(shí)收集樣本、分析在診斷、臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。現(xiàn)有技術(shù)是穩(wěn)定和便宜的，但不能生成及時(shí)指導(dǎo)治療的初始階段結(jié)果。在本研究中，探索了微流控裝置與多孔二氧化硅單體作為簡(jiǎn)單的通流元件，用于選擇性血細(xì)胞分析和細(xì)菌的完整分離，單體是由具有流體扭曲路徑開(kāi)放細(xì)胞形態(tài)組成的多孔材料。

科學(xué)家可以在細(xì)胞灌注過(guò)程中通過(guò)高機(jī)械表面應(yīng)力來(lái)控制整體孔的形態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的機(jī)械溶血，同時(shí)允許完整、活的細(xì)菌通過(guò)彎曲流動(dòng)路徑進(jìn)行無(wú)培養(yǎng)分離。研究對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌采用全血流動(dòng)條件下細(xì)菌選擇性傳代的方法，盡管菌株不同。高通量選擇性單核細(xì)胞裂解技術(shù)與拉曼光譜等強(qiáng)大的分析方法相結(jié)合，可以在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)全血中的細(xì)菌進(jìn)行無(wú)培養(yǎng)分析。研究對(duì)之前的二氧化硅單體合成工藝進(jìn)行了改進(jìn)，然后水解和縮合二氧化硅，在低溫下形成二氧化硅玻璃。

為了制備二氧化硅單體，科學(xué)家們使用了由烷基硅酸鹽、聚乙二醇(PEG)作為致孔劑、尿素作為羥基離子來(lái)源的前驅(qū)體溶液，以盡量減少異質(zhì)性和乙酸。當(dāng)優(yōu)化合成工藝時(shí)，得到的單體是均勻的，并且很好地固定在硅毛細(xì)管壁上。科學(xué)家們測(cè)量了最終骨骼整體結(jié)構(gòu)的厚度，并用高效液相色譜法計(jì)算了其滲透性，以控制實(shí)驗(yàn)條件。為了最大限度地減小內(nèi)部變化，將產(chǎn)生的毛細(xì)管切割成5厘米長(zhǎng)的段，在使用前測(cè)試滲透率。

然后研究人員開(kāi)發(fā)了兩種互補(bǔ)的低通量和高通量操作方法，將二氧化硅單體集成到微流體系統(tǒng)中。為了實(shí)現(xiàn)低通量操作，科學(xué)家們?cè)跓崴苄晕⒘黧w芯片中嵌入了含有單體的毛細(xì)管段，以在集成過(guò)程中保護(hù)單體。對(duì)于高通量選擇性裂解，使用了微流體裝置中具有較大橫截面積的單體。完整的制作方法為全血灌注過(guò)程中無(wú)泄漏操作提供了良好可靠性。研究人員選擇陰溝腸桿菌(革蘭氏陰性，桿狀菌)和3種革蘭氏陽(yáng)性菌作為原理驗(yàn)證，探討其傳輸率；乳酸乳球菌、黃體微球菌和枯草芽孢桿菌。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用不同幾何形狀和流動(dòng)條件的微流體單體灌注細(xì)菌溶液，利用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)細(xì)菌的通過(guò)和血細(xì)胞的裂解。例如，純化后的陰溝腸桿菌經(jīng)單塊體灌注后，DLS峰沒(méi)有明顯變化，表明細(xì)菌的通道完整。科學(xué)家們證明了多孔整體器的長(zhǎng)度對(duì)紅細(xì)胞裂解效率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)單核細(xì)胞長(zhǎng)度大于1mm時(shí)，紅細(xì)胞裂解效率顯著提高。也研究了白細(xì)胞(WBCs)在單核細(xì)胞裝置運(yùn)行過(guò)程中的命運(yùn)，細(xì)胞在不被類似RBCs的裂解的情況下無(wú)法通過(guò)單核細(xì)胞。

從技術(shù)上講，紅細(xì)胞變形為盤狀，通過(guò)單核細(xì)胞，導(dǎo)致膜張力顯著增加，導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解。相比之下，細(xì)菌細(xì)胞的尺寸與單粒石孔隙相似，因此成功通過(guò)而不破裂需要更少的細(xì)胞壁膨脹。科學(xué)家們優(yōu)化了設(shè)備參數(shù)，使不同細(xì)菌能夠承受高水平的膜應(yīng)力而不破裂。進(jìn)一步的發(fā)展確保了細(xì)菌的完整傳代而不降解，并具有生存能力。為了獲得高通量細(xì)菌通道，科學(xué)家們稀釋了毛細(xì)管裝置中的血液。然而，作為另一種選擇，它們也可以擴(kuò)大整體血液溶解的能力。

該裝置處理超過(guò)400μL摻入細(xì)菌的全血，然后由于細(xì)胞裂解導(dǎo)致的堵塞以及由于多孔基質(zhì)內(nèi)捕獲的完整白細(xì)胞（WBC）而顯示出背壓的顯著增加。為了定位目標(biāo)細(xì)菌，將一個(gè)沉積在玻璃載玻片上的樣品，該樣品經(jīng)過(guò)了整塊處理。通過(guò)手工掃描光學(xué)探針對(duì)樣品進(jìn)行單細(xì)胞拉曼分析。研究人員希望在未來(lái)利用選擇性裂解技術(shù)，結(jié)合共焦拉曼顯微鏡來(lái)改進(jìn)在確定的感興趣的位置，以低濃度檢測(cè)感興趣菌株的過(guò)程。共焦拉曼顯微鏡工具與新興的小型化手持系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，為快速便攜的護(hù)理點(diǎn)設(shè)備鋪平道路。

Copyright Science X Network/Thamarasee Jeewandara/Phys參考期刊《Nature Medicine》《PLoS ONE》《Microsystems & Nanoengineering》DOI: 10.1038/nm.3640DOI: 10.1371/journal.pone.0116837DOI: 10.1038/s41378-019-0063-4