大家好！今天跟大家分享一篇我們課題組最近發(fā)表在Angewandte Chemie International Edition的文章，題目為 “DNA Nanolithography Enables Highly Ordered Recognition Interface in Microfluidic Chip for Efficient Capture and Release of Circulating Tumor Cells”。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)頂點(diǎn)懸垂核酸適體的四面體DNA納米結(jié)構(gòu)，其作為具有納米精度的識(shí)別元件，可通過(guò)化學(xué)修飾的方法錨定到確定性側(cè)向位移(DLD)模式的微流控芯片上，然后實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的高效捕獲和釋放，并通過(guò)數(shù)字液滴PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行下游基因突變分析。

【背景介紹】

隨著微加工技術(shù)的發(fā)展，微流體技術(shù)的應(yīng)用取得了重大的進(jìn)展。納米級(jí)微流控芯片展示出巨大的應(yīng)用潛力，納米-微米結(jié)構(gòu)構(gòu)筑的跨尺度界面，可不受傳質(zhì)阻力的限制，從而改善界面上分子識(shí)別的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種用于微米級(jí)結(jié)構(gòu)的制造方法，但可重復(fù)地制備具有高精度尺寸的納米級(jí)結(jié)構(gòu)在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性。例如電子束光刻和納米壓印技術(shù)等雖可制備高分辨率納米結(jié)構(gòu)但由于依賴大型昂貴設(shè)備及多步處理步驟，限制了其廣泛應(yīng)用。

核酸適體是一條單鏈的DNA或RNA，能自發(fā)折疊成特異的三維結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)高親和力、高特異性識(shí)別靶標(biāo)分子。與抗體相比，核酸適體用于CTC分析，顯示出許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如良好的物理穩(wěn)定性、低成本、易于改造修飾且批次間差異很小。目前已開(kāi)發(fā)核酸適體的CTC微流控體系，大多是通過(guò)物理吸附、化學(xué)反應(yīng)或生物分子識(shí)別將核酸適體連接到基質(zhì)界面。然而，核酸適體的結(jié)構(gòu)會(huì)受到鏈間纏繞以及適體與芯片界面之間非特異性相互作用的影響，在很大程度上限制了核酸適體對(duì)CTCs上所表達(dá)標(biāo)志物的識(shí)別作用，致使目前適體微流控芯片對(duì)CTC捕獲效果不理想。

DNA分子由于其精確和可編程的核苷酸堿基配對(duì)原則，可以精準(zhǔn)組裝成多種形狀、大小和尺寸的DNA納米結(jié)構(gòu)。其中，四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（TDN）可作為定向修飾識(shí)別分子的剛性框架，有望作為功能分子和微流控界面之間的橋梁，避免常規(guī)微流控界面上核酸適體修飾產(chǎn)生的不良取向或擁擠效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)功能分子的均勻垂直界面修飾。

 【設(shè)計(jì)思路】

作者首先設(shè)計(jì)了一個(gè)頂點(diǎn)懸垂核酸適體SYL3C(針對(duì)CTCs標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM)）的四面體DNA納米結(jié)構(gòu)（SYL3C-TDN），然后通過(guò)化學(xué)修飾的方法錨定到確定性側(cè)向位移(DLD)模式的微流控芯片(ApTDN-Chip)上 (如圖1)。剛性的四面體DNA框架通過(guò)“DNA納米光刻”，可實(shí)現(xiàn)核酸適體呈高度有序且直立的納米形貌排布，有利于適體對(duì)CTC的識(shí)別作用。而DLD芯片通過(guò)尺寸選擇，可提高CTC與微柱之間的碰撞效率，同時(shí)最大程度地減少血細(xì)胞與微柱之間的碰撞。此外，四面體DNA支架還通過(guò)在界面上合理的空間間距降低了核酸適體的局部擁擠效應(yīng)，使DNA核酸酶(DNaseⅠ)更易于與核酸適體作用，從而實(shí)現(xiàn)捕獲后細(xì)胞的有效釋放。最后可利用數(shù)字液滴PCR技術(shù)對(duì)釋放的CTC開(kāi)展下游分子生物學(xué)分析。

圖1. ApTDN-Chip的工作原理

【數(shù)據(jù)介紹】

SYL3C-TDN由一條含有核酸適體SYL3C片段的DNA長(zhǎng)鏈（Apt-A）和三條DNA單鏈一步合成得到，與TDN有相似的高產(chǎn)率（超過(guò)85%），且重現(xiàn)性好。如圖2A、B所示，SYL3C-TDN 能夠維持核酸適體SYL3C特異性識(shí)別EpCAM表達(dá)陽(yáng)性的SW480細(xì)胞系的能力，同時(shí)避免非特異性吸附。為了驗(yàn)證TDN作為納米支架在界面上的優(yōu)勢(shì)，作者將不同濃度的SYL3C-TDN和SYL3C通過(guò)鏈霉親和素和生物素作用修飾到磁珠上，然后投入相同數(shù)量的SW480細(xì)胞系。通過(guò)分析靶細(xì)胞的回收率，可以得到界面上SYL3C-TDN的平衡解離常數(shù)（K_d）為7.11 ± 0.98 nM（圖2D），相比于界面上SYL3C的親和能力降低了4倍（K_d=30.46 ± 3.20 nM，圖2C）。此外，在均相溶液中，SYL3C-TDN表現(xiàn)出與SYL3C相似的親和能力。由此可見(jiàn)，四面體DNA支架能夠提高核酸適體在界面上的識(shí)別熱力學(xué)。

圖2. SYL3C-TDN識(shí)別能力的探究

為了進(jìn)一步探究微流控芯片中DNA納米界面對(duì)于提高細(xì)胞捕獲效率的作用，作者設(shè)計(jì)了四種不同類型的微納界面（圖3A）。其中，生物素標(biāo)記的DNA通過(guò)鏈霉親和素修飾到微流體界面是常用的芯片修飾策略。然而，鏈霉親和素以無(wú)序的形式隨機(jī)固定在微流體界面上，使得DNA以一個(gè)取向雜亂的狀態(tài)存在，這大大降低了DNA分子識(shí)別效率。而TDN作為分子支架，為核酸適體提供直立的取向和可控的間距，使得ApTDN-Chip展示出較高的捕獲效率（在緩沖液中87.4%），與另外三種微納米界面相比，捕獲效率提高了20-60%（圖3B）。此外，ApTDN-Chip在模擬病人血樣中仍保持較高的捕獲效率。同時(shí)，ApTDN-Chip對(duì)于白細(xì)胞和EpCAM表達(dá)陰性的Ramos細(xì)胞系的非特異性吸附與另外三種微納米界面是相似的（圖3B、C）。

圖3.核酸適體不同微納米界面修飾的性能探究

高效無(wú)損釋放CTCs對(duì)于下游分析十分重要。近年來(lái)，研究人員開(kāi)發(fā)了多種用于核酸適體的微流控芯片的釋放方案，如熱裂解、互補(bǔ)序列雜交和核酸酶水解。然而，它們的釋放效率往往會(huì)因?yàn)榻缑嫔暇植繐頂D效應(yīng)或識(shí)別分子和界面的非特異性吸附，難以達(dá)到理想效果。基于此，四面體DNA支架為SYL3C-TDN在界面上提供合理的空間間距，能減小局部分子擁擠效應(yīng)，使得DNaseⅠ更好的水解DNA序列。如圖4A，ApTDN-Chip中捕獲后的腫瘤細(xì)胞幾乎80%會(huì)被釋放，比Apt-Chip的釋放效率高約30%。這一釋放策略是通過(guò)水解核酸適體實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的釋放，因而非特異性吸附的白細(xì)胞大部分仍留在微通道表面，使得釋放后CTCs的純度能夠進(jìn)一步提升（圖4C）。此外，如圖4D、E所示，釋放后的細(xì)胞活性仍保持較高的水平（90.8%），有利于后續(xù)下游分子生物學(xué)分析。

CTC攜帶突變基因信息，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中是一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，例如一些對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抗體治療產(chǎn)生耐藥性的病人往往會(huì)存在KRAS基因突變，而隨著腫瘤的發(fā)展，KRAS突變也會(huì)隨之發(fā)生改變。因此，作者通過(guò)數(shù)字液滴PCR技術(shù)可對(duì)回收后的CTCs進(jìn)行KRAS突變檢測(cè)。模擬病人樣本驗(yàn)證ApTDN-Chip的捕獲-釋放策略，可檢測(cè)出低至每毫升20個(gè) SW480細(xì)胞所攜帶的KRAS基因突變信息，檢測(cè)出每微升15.4的拷貝數(shù)（圖4F、G）。此外，ApTDN-Chip技術(shù)也被應(yīng)用于病人外周血CTC捕獲及下游KRAS基因突變檢測(cè)，突變檢測(cè)結(jié)果和臨床組織穿刺結(jié)果具有良好的一致性。

圖4. ApTDN-Chip下游分析探究

【總結(jié)】

本文展示了“DNA納米光刻”用于構(gòu)建有序微流控芯片識(shí)別界面的潛力。剛性的四面體DNA支架為核酸適體提供高度有序的直立方向和可控間距，從而促進(jìn)核酸適體在界面的有效識(shí)別。與傳統(tǒng)的納米級(jí)微流控界面加工方法相比，該平臺(tái)易于制造并表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。這種具有高精度尺寸的納米級(jí)框架結(jié)構(gòu)作為識(shí)別分子和微流控界面之間的橋梁，改善了識(shí)別分子在界面修飾上的分子識(shí)別的熱力學(xué)。利用“DNA納米光刻”實(shí)現(xiàn)微流控界面功能化有望用于許多領(lǐng)域，如無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)、循環(huán)腫瘤外泌體和各種生物標(biāo)記物的檢測(cè)以及細(xì)胞行為調(diào)控。

該工作由課題組和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科聯(lián)合攻關(guān)完成。2018級(jí)碩士研究生張佳露為論文的第一作者，宋彥齡、楊朝勇及胃腸外科趙剛為本文共同通訊作者。
撰稿人：張佳露（碩士生）

校稿：宋 佳

原文鏈接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202005974

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